一、銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌，是引起急性或慢性感染的最常見的條件致病菌之一，由其引起的院內(nèi)感染往往治療難度極大，幾乎具有目前已知的細(xì)菌主要耐藥機(jī)制，已成為引起院內(nèi)獲得性肺炎多重耐藥革蘭陰性菌的代表，PA 感染是治療的難題，歸其原因，在于其廣泛而多重的耐藥性[1]。

微生物耐藥機(jī)制類型[2]

1、微生物常見的抗生素耐藥機(jī)制（下圖）包括：（1）降低細(xì)胞膜通透性；（2）水解酶溶菌/滅活藥物；（3）藥物修飾；（4）細(xì)胞靶點(diǎn)突變，使抗生素不能有效地與特定靶點(diǎn)結(jié)合；（5）通過跨膜外排泵系統(tǒng)主動(dòng)排出藥物；（6）藥物抑制。

2、主動(dòng)外排是細(xì)菌將有害物質(zhì)（包括抗生素）排放到細(xì)胞外的現(xiàn)象，也是引起MDR的主要方式，這個(gè)過程涉及到外排系統(tǒng)對(duì)外排底物的識(shí)別、固定和輸送。根據(jù)氨基酸序列同源性和底物特異性，一般將這些外排泵分為5大類（下圖）：

1）多藥及毒性化合物外排分子家族（multi-antimicrobial and toxic compound extrusion，MATE）；

2）小多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)分子家族（small multidrug resistance family，SMR）；

3）ATP結(jié)合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily，ABC）；

4）主要促進(jìn)劑超家族（major facilitator superfamily，MFS）；

5）耐藥性結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化分子家族（resistance nodulation division family，RND）。

3、作用機(jī)制

1）MATE是由質(zhì)子勢(shì)能和鈉離子濃度梯度共同提供能量將藥物泵出胞外；

2）SMR是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用質(zhì)子交換驅(qū)動(dòng)藥物外排，EmrE是其代表成員之一；

3）ABC利用NBD水解ATP為細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量；

4）MFS是利用胞內(nèi)外的質(zhì)子濃度梯度提供的化學(xué)勢(shì)能為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)供能；

5）RND是外膜蛋白（OMP）與內(nèi)膜蛋白（IMP）形成轉(zhuǎn)運(yùn)通道，二者與周質(zhì)膜融合蛋白（MFP）相互作用，促使外排泵系統(tǒng)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)藥物外排。

RND泵表現(xiàn)出廣泛的特異性，其三部結(jié)構(gòu)允許將化合物直接從細(xì)胞質(zhì)擠壓到外部環(huán)境。三部結(jié)構(gòu)分別為

膜融合蛋白或連接蛋白（MFP）：MexA、MexC、MexE、以及MexX，

內(nèi)膜蛋白（IMP）：MexB、MexD、MexF以及MexY，

外膜通道蛋白（OMP）：OprM、OprJ、以及OprN。

其中研究較多的有4種類型：MexAB-OprM 、 MexCD-OprJ 、MexEF-OprN、和MexXY-OprM。

二、替加環(huán)素

替加環(huán)素 (Tigecycline， GAR 936) ，又稱甘氨酞環(huán)素 (glycylcycline)，是繼多西環(huán)素、米諾環(huán)素、美他環(huán)素后開發(fā)的新一代四環(huán)素類抗生素，為個(gè)甘氨酰環(huán)類抗菌藥物，為米諾環(huán)素衍生物。通過與核糖體 30 S 亞單位結(jié)合、阻止氨?；?tRNA 分子進(jìn)入核糖體 A 位而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，同時(shí)阻止了肽鏈因合并氨基酸殘基而延長(zhǎng)。與四環(huán)素相比，在中央的骨架的側(cè)鏈上，在第9位以D環(huán)甘氨酰環(huán)代替了 N2烷基2甘氨酰氨基。使抗菌譜更廣，抗菌活性更強(qiáng)，而且使它得以能克服大多數(shù)細(xì)菌對(duì)四環(huán)素耐藥機(jī)制的產(chǎn)生。

替加環(huán)素在體外對(duì)大多數(shù)細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性與革蘭氏陰性需氧與厭氧菌，包括金黃色葡萄球菌、腸球菌、肺炎球菌、流感嗜血桿菌、粘膜炎莫拉菌、淋球菌、消化鏈球菌屬、梭狀芽胞桿菌、擬桿菌有很好的抗菌活性。但對(duì)銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌無抗菌活性，對(duì)吲哚陽(yáng)性的變形桿菌族與奇異變形桿菌僅能起抑制作用[4-5]。

三、PA對(duì)替加環(huán)素的耐藥機(jī)制[3]

1、PA對(duì)替加環(huán)素的天然抗性，是由MexXY-OprM外排泵介導(dǎo)的

通過研究發(fā)現(xiàn)，在沒有刪除任何基因片段的條件下，銅綠假單胞菌（K767株）對(duì)替加環(huán)素的敏感度很差（MIC＞8mg/l）。以往的研究表明，通常情況下，PA通常不會(huì)產(chǎn)生MexCD-OprJ 和 MexEF-OprN這兩種外排泵，因此這兩種外排泵不會(huì)參與PA的耐藥。而MexAB-OprM在天然情況下會(huì)產(chǎn)生，但是通過表2可以得知，被刪除了mexB基因片段了的PA（K1523株）對(duì)替加環(huán)素依然耐藥。MexXY基因的表達(dá)，需要通過多種抗菌藥物（包括替加環(huán)素）的誘導(dǎo)。刪除mexXY基因后的PA（K1525株），表現(xiàn)除了對(duì)替加環(huán)素敏感性的顯著增加，表明MexXY介導(dǎo)的外排泵可顯著性降低PA對(duì)替加環(huán)素的敏感性。與mexAB-oprM、mexCD-oprJ和mexEF-oprN不同，mexXY基因座沒有編碼外膜成分的相關(guān)基因。一些證據(jù)表明MexAB-OprM外排泵的OprM成分為銅綠假單胞菌的MexXY提供了外膜通道功能。表2顯示，刪除了mexAB-oprM基因的PA（K1119株）與刪除了mexXY基因的PA（K1525株）對(duì)替加環(huán)素的有相同的敏感性，而僅有mexB基因丟失的PA（K1523株）對(duì)替加環(huán)素的敏感性并沒有明顯增加。因此，強(qiáng)烈表明了oprM與MexXY介導(dǎo)的外排泵與PA的耐藥性有特異性關(guān)聯(lián)，有力地支持了oprM與MexXY是共同作用的外膜通道的觀點(diǎn)。

2、替加環(huán)素、四環(huán)素可誘導(dǎo)PA產(chǎn)生Mex X、Mex Y基因

給予不同濃度的替加環(huán)素，發(fā)現(xiàn)在1μg/ml時(shí)，mexX、mexY分別有13.43和12.85倍的表達(dá)，四環(huán)素在4μg/ml時(shí)，也表現(xiàn)出同樣的結(jié)果，表明盡管它們兩者的結(jié)構(gòu)不同，但都是mexXY強(qiáng)誘導(dǎo)劑。這也表明四環(huán)素及其衍生物誘導(dǎo)MexXY外排泵的表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)的。但是，不同濃度都不能使oprM表達(dá)增強(qiáng)，表明編碼MexXY-oprM泵外膜通道成分的oprM的轉(zhuǎn)錄并不是由替加環(huán)素或四環(huán)素誘導(dǎo)的。

3、PA獲得性耐藥

為了測(cè)試MexXY的特異性抑制可能有助于將替加環(huán)素的活性擴(kuò)展到包括銅綠假單胞菌的可能性，將MexXY-oprM完全被抑制的PAO1-MexXY（K1525）、mexB/MexXY（K1542株）和mexAB-oprM（K1119）菌株放在含有4或6μg/ml替加環(huán)素的L-瓊脂平板上，發(fā)現(xiàn)三株菌種很快就產(chǎn)生了對(duì)該濃度替加環(huán)素具有抗性的自發(fā)突變體。來自每個(gè)親本菌株的兩個(gè)代表性突變體（來自mexXY突變體菌株的XY1和XY3，來自mexB/mexXY突變體菌株的BXY1和BXY4，以及來自mexAB oprM突變體菌株的M1和M9）的敏感譜如表2所示。每個(gè)突變體對(duì)替加環(huán)素的敏感性都降低到了銅綠假單胞菌（野生型）的固有水平，且表現(xiàn)出多藥耐藥表型，表明外排泵參與獲得性耐藥的可能性。也表明即使缺少了MexXY-OprM外排泵，PA也能產(chǎn)生替代性的外排泵以迅速對(duì)替加環(huán)素發(fā)生耐藥，說明特異性抑制MexXY不能提高替加環(huán)素對(duì)PA敏感性。

4、替加環(huán)素也是MexAB-OprM的作用底物

在缺乏了mexXY基因后，突變菌株XY3對(duì)替加環(huán)素的敏感性也降低，研究發(fā)現(xiàn)是出現(xiàn)了過度表達(dá)MexAB-OprM，表明替加環(huán)素也是MexAB-OprM的底物。而MexAB-OprM對(duì)替加環(huán)素的顯著外排似乎僅在沒有MexXY的情況下發(fā)生，這意味著當(dāng)兩個(gè)泵都存在時(shí)，替加環(huán)素優(yōu)先被MexXY-OprM識(shí)別。

5、替加環(huán)素也是MexCD-OprJ的作用底物

突變株XY1來源于缺失了mexXY的K1525株，與突變株XY3的不同之處在于它不表現(xiàn)出對(duì)羧芐青霉素的耐藥性（表2）。突變體BXY1、BXY4、M1和M9（表2）在耐藥性方面似乎都與XY1屬于同一類，對(duì)氯霉素和頭孢吡肟有很高的耐藥性，對(duì)羧芐青霉素的敏感性增加，提示存在MexCD-OprJ介導(dǎo)的外排。BXY1和M1對(duì)替加環(huán)素的敏感性降低是由MexCD-OprJ介導(dǎo)的，但是MexCD-OprJ在外排替加環(huán)素方面可能不如MexXY-OprM有效。

6、外排甘氨酰環(huán)素

比較多西環(huán)素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、替加環(huán)素以及三種新型甘氨酰環(huán)素對(duì)原生型、基因刪除型、突變型PA菌株的敏感譜發(fā)現(xiàn)（表4），缺失了mexAB-oprM的PA菌株（K1119），因缺乏mexAB-oprM和MexXY-oprM外排泵的作用，與比原生型菌株（K767株）相比對(duì)四環(huán)素的敏感性增強(qiáng)（MIC均≤0.5 mg/l）。菌株K1525因mexXY基因的特異性缺失，對(duì)甘氨酰環(huán)素的敏感性與缺失mexAB-oprM基因菌株（K1119）類似，而對(duì)非甘氨酰四環(huán)素（米諾環(huán)素、多西環(huán)素、西環(huán)素）的敏感性則小得多（MIC≥4mg/L）。被刪除了mexXY和mexB基因的菌株（K1542）增加了對(duì)非甘氨酰四環(huán)素的敏感性，情況與mexAB-oprM菌株（K1119）相似。因此，米諾環(huán)素和多西霉素主要由MexAB-OprM排出，少量由MexXY-OprM排出。替加環(huán)素、DMG-MINO、DMG-DMDOT和PAM-MINO的外排由MexXY-OprM主要負(fù)責(zé)，MexAB-OprM在其中的作用似乎較少。

刪除了mexXY基因后的突變菌株XY3，代償性的產(chǎn)生了MexAB-OprM外排泵，導(dǎo)致對(duì)米諾環(huán)素和多西環(huán)素的敏感性降低，MIC高達(dá)64mg/L，而對(duì)甘氨酰環(huán)素的MIC都沒超過8mg/L。類似的情況出現(xiàn)在BXY1和M1菌株，在沒有了MexAB-OprM和MexXY-OprM外排泵的情況下，由于MexCD-OprJ外排泵的作用，對(duì)多西環(huán)素、米諾環(huán)素的MIC為128mgL，對(duì)甘氨酰環(huán)素的MIC在8-16mg/L。因此，表明，MexCD-OprJ外排泵對(duì)甘氨酰環(huán)素的影響較小。

結(jié) 論

1、MexXY-OprM外排泵可降低銅綠假單胞菌對(duì)替加環(huán)素（和其他甘氨酰環(huán)素）的敏感性。抑制MexXY-OprM活性后，很容易引起MexAB-OprM或MexCD-OprJ或可能的其他外排泵的過度表達(dá)，進(jìn)行代償性外排。與先前四環(huán)素特異性外排泵相比，甘氨酰化四環(huán)素不能克服RND家族泵的外排，且能誘導(dǎo)先天表達(dá)的特定泵的發(fā)生相對(duì)變化，即從針對(duì)半合成四環(huán)素的MexAB-OprM轉(zhuǎn)變?yōu)獒槍?duì)甘氨酰四環(huán)素的MexXY-OprM。

所以，因銅綠假單胞菌具有高表達(dá)MexXY-OprM、MexAB-OprM、MexCD-OprJ外排泵，可將替加環(huán)素外排至細(xì)胞外，所以其對(duì)替加環(huán)素天然耐藥。

有研究顯示，應(yīng)用替加環(huán)素后至檢出銅綠假單胞菌的中位時(shí)間為 11d，因此需要警惕使用替加環(huán)素繼發(fā)的銅綠假單胞菌感染[4]。

參考資料

[1]鄭璇兒, 楊杰. 銅綠假單胞菌耐藥性的基因?qū)W研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版), 2014, 000(001):111-113.

[2]Armel, Jackson,  Seukep V , et al. Plant-derived secondary metabolites as the main source of efflux pump inhibitors and methods for identification[J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2020, v.10(04):5-18.

[3] Dean C R ,  Visalli M A ,  Projan S J , et al. Efflux-mediated resistance to tigecycline (GAR-936) in Pseudomonas aeruginosa PAO1.[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003, 47(3):972-978.

[4]陳子晞, 王弋. 替加環(huán)素治療中銅綠假單胞菌的定植與感染[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2014, 000(007):911-913.

[5]程仕虎, 王睿. 新一代四環(huán)素類藥物替加環(huán)素的研究進(jìn)展[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程, 2007, 7(16):4123-4130.