背景及概述[1][2]
四環(huán)素為代四環(huán)素類抗生素，其具有廣譜抗菌特點(diǎn)，可抵抗如革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌、衣原體、支原體和原生物類寄生蟲等多種微生物。另外對很多青霉素敏感的人群，可以用四環(huán)素類抗生素作為替代品治療某些疾病。由于其造價不高，廣泛應(yīng)用于對人類和動物感染的治療。
提純[1]
四環(huán)素的提純方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）、四環(huán)素粗品的制備：將金色鏈霉菌孢子在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后加草酸進(jìn)行酸化處理，過濾得到濾液，濾液在堿性條件下加入鈣鹽進(jìn)行沉淀，沉淀物經(jīng)酸洗后得到四環(huán)素粗品；
2）、四環(huán)素粗品的干燥：將四環(huán)素粗品放置在真空干燥箱中進(jìn)行干燥，干燥溫度為50℃-60℃；
3）、四環(huán)素-無機(jī)鹽溶解液的制備：將干燥后的四環(huán)素粗品用無機(jī)鹽飽和溶液溶解，調(diào)節(jié)pH值為2-4；即得四環(huán)素-無機(jī)鹽溶解液；
4）、四環(huán)素-無機(jī)鹽溶解液的沉淀：向四環(huán)素-無機(jī)鹽溶解液中滴加氨水調(diào)節(jié)pH值至3-5，降溫至0-10℃，靜止1-2小時析出四環(huán)素-無機(jī)鹽沉淀；5）、重結(jié)晶-熱結(jié)晶：將步驟4）得到的四環(huán)素-無機(jī)鹽沉淀在攪拌條件下加入到有機(jī)溶劑A中，待全部加入后滴加鹽酸，攪拌至四環(huán)素-無機(jī)鹽沉淀全部溶解，升溫至50℃-60℃，再慢慢加入有機(jī)溶劑B，保溫50min-60min，析出四環(huán)素精制晶體；
所述有機(jī)溶劑A為乙醇、乙二醇、異丙醇、異丁醇、叔丁醇或丙酮；
所述有機(jī)溶劑B為乙醚、異丙醚、乙酸乙酯、醋酸乙酯、丙烯酸甲酯或磷酸甲酯；
6）、重結(jié)晶-冷結(jié)晶：將步驟5）的體系放置在0-10℃的冷水浴進(jìn)行冷結(jié)晶，析出四環(huán)素精制晶體，待完全結(jié)晶后進(jìn)行減壓抽濾，用機(jī)溶劑A洗滌晶體，得到四環(huán)素濕晶體；
7）、將步驟6）得到的四環(huán)素濕晶體在干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥處理得到四環(huán)素。
殘留檢測[2]
快速檢測牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的方法，具體包括下述步驟：
1)NaYF4：Yb，Er納米粒子的制備
分別取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入過量的HNO3溶液加熱反應(yīng)，溶液蒸發(fā)后加入 去離子水定容分別得到濃度分別為1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L 的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和的ErNO3溶液3mL混合均勻，緩慢加入 1mmol的檸檬酸鈉溶液后超聲后混合均勻；磁力攪拌下緩慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混 合溶液中有白色沉淀出現(xiàn)，使用NaOH溶液將混合溶液的pH值調(diào)為5，磁力攪拌1h后轉(zhuǎn)移至均 相反應(yīng)器中，180℃保溫反應(yīng)4h，冷卻至室溫并將混合液離心，離心轉(zhuǎn)速為10000rpm，離心時 間為10min；使用無水乙醇洗滌一次，然后再用雙蒸水洗滌三次；洗滌完畢后置于60℃恒溫 干燥12h，即得NaYF4：Yb，Er納米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er納米粒子的制備：
將20mg NaYF4：Yb，Er粉末加入到30mL的正丙醇溶液，超聲磁力攪拌40min，向其中 滴入1.25mL氨水溶液和10mL水，然后轉(zhuǎn)移至35℃的恒溫水浴中磁力攪拌1h；向其中緩慢滴 加10μLTEOS溶液和正丙醇的混合溶液，繼續(xù)反應(yīng)4h；接著將0.1mL APTES和正丙醇的混合溶 液滴入到上述溶液中，持續(xù)攪拌1h；攪拌完畢后10000rpm下離心10min，用無水乙醇洗滌沉 淀物3次；將沉淀物置于60℃干燥12h，即得功能化的NaYF4：Yb，Er納米粒子；
3)四環(huán)素類抗體連接
取20mg功能化的NaYF4：Yb，Er的納米粒子溶解到5mL 0.01mol/L的PBS中，然后緩 緩加入1.25mL 25％的戊二醛溶液和100mg硼氫化鈉，混合均勻室溫下緩慢振蕩反應(yīng)1h，混 合溶液在10000rpm下離心10min，使用0.01mol/L的PBS溶液洗滌三次，將沉淀物重新分散在 5mL的0.01mol/L PBS中，加入30μg的四環(huán)素類抗體和100mg的硼氫化鈉，室溫下繼續(xù)振蕩 1h；然后加入100mg的Tris為封閉劑，繼續(xù)振蕩反應(yīng)1h；所得的產(chǎn)物離心、用PBS溶液洗滌3次 后，重新分散在1mL PBS中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
4)合成金納米
稱取0.0216g氯金酸溶于237.5mL去離子水，劇烈攪拌并加熱至沸騰；稱取0.125g 檸檬酸鈉溶于12.5mL去離子水中，在磁力攪拌下將檸檬酸鈉溶液快速加入到氯金酸溶液 中，繼續(xù)水浴中攪拌直至溶液呈現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)加熱回流30min，冷卻到室溫得到冷卻溶液， 稱取0.0042g PVP溶于1mL去離子水中，再將其加入到冷卻溶液中，室溫?cái)嚢?4h，自然冷卻 至室溫，即得金納米，4℃避光保存；
5)金納米和四環(huán)素類抗原連接
取5mL金納米，用pH為9.0的0.01mol/L PBS溶液將其pH值調(diào)為8.0，加入20μg的四 環(huán)素類抗原，冰水浴中攪拌1h；然后加入25mg的BSA作為封閉劑，繼續(xù)攪拌1h，4℃離心轉(zhuǎn)速 為10000rpm，離心時間為10min，使用0.01mol/L的PBS洗滌三次，移去上層溶液，最后用5mL 0.01mol/L的pH為7.0的PBS溶液收集，得到四環(huán)素類抗原-BSA-金納米溶液，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>
6)確定以及優(yōu)化四環(huán)素類抗體-NaYF4：Yb，Er溶液和四環(huán)素類抗原-BSA-金納米溶 液為基礎(chǔ)的四環(huán)素類熒光能量共振轉(zhuǎn)移體系：
取1.5mL的小試管加入定量的游離的四環(huán)素類抗原，然后在每個小試管中分別加 入30μg/mL的四環(huán)素類抗體偶聯(lián)的NaYF4：Yb，Er溶液100μL，接著每個試管加入20μg/mL四環(huán) 素類抗原-BSA-金納米溶液，分別為10、20、40、80、160μL，最后，加入適量的PBS溶液，使得游 離的四環(huán)素類抗原的最終濃度為100ng/mL放到搖床上緩慢振搖0.5h，接著進(jìn)行熒光測定； 對照組試管中不添加游離的抗原溶液，加入與實(shí)驗(yàn)組相同的四環(huán)素類抗體偶聯(lián)的NaYF4： Yb，Er溶液和四環(huán)素類抗原偶聯(lián)的金納米溶液，反應(yīng)后也進(jìn)行熒光測定；通過實(shí)驗(yàn)組和對照 組的熒光恢復(fù)的變化量來確定四環(huán)素類抗體-NaYF4：Yb，Er溶液和四環(huán)素類抗原-BSA-金納 米溶液的適濃度，形成良好的上轉(zhuǎn)換納米材料-金納米材料體系；
7)確定四環(huán)素類藥物在牛奶中的檢測范圍
在牛奶中摻雜一系列不同濃度的四環(huán)素類抗原，取若干個1.5mL的小試管，每個小 試管做好標(biāo)記，在小試管中加入含有不同含量的四環(huán)素類抗原的牛奶溶液，牛奶溶液中的 四環(huán)素類含量分別為0.1，1，5，10，30，50，75，100，500，1000ng，然后加入30μg/mL的四環(huán)素 類抗體-NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反應(yīng)0.5h后加入適量20μg/mL四環(huán)素類抗原-BSA-金納米 溶液；然后依次向每個小試管中加入用PBS溶液使得最終溶液的體積為200μL，然后放到搖 床上緩慢振蕩40min，進(jìn)行熒光測定；
8)按照步驟7)中的檢測范圍，檢測一定范圍內(nèi)含有其他抗生素類牛奶樣品的熒光 強(qiáng)度，并根據(jù)熒光強(qiáng)度和四環(huán)素類抗原濃度的關(guān)系，觀察該方法是否具有特異性，能否檢測 含有四環(huán)素類抗生素的牛奶樣品。如上所述的方法中所述的四環(huán)素類抗原抗體能夠?qū)Χ喾N 四環(huán)素類藥物，如四環(huán)素、氯四環(huán)素、土霉素或金霉素等有良好的交叉反應(yīng)性，能夠檢測多種四環(huán)素類抗生素。
主要參考資料
[1] CN201610413722.9 基于提高四環(huán)素純度的提純方法
[2] [中國發(fā)明] CN201810460705.X 一種快速檢測牛奶中四環(huán)素類藥物殘留的方法