研究背景

抗生素的使用顯著減少了細(xì)菌感染引起的死亡。然而，抗生素的過(guò)度使用和濫用同樣導(dǎo)致了抗生素耐藥性的出現(xiàn)。盡管如此，人類(lèi)生活仍離不開(kāi)抗生素。四環(huán)素是臨床和農(nóng)業(yè)環(huán)境中使用最廣泛的抗生素之一，在2010年美國(guó)臨床處方中排名前三。四環(huán)素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有廣譜活性。與其他抗生素相比，多西環(huán)素、米諾環(huán)素等四環(huán)素類(lèi)藥物具有更好的組織滲透性，口服生物利用度高且價(jià)格低廉。然而，四環(huán)素耐藥性在細(xì)菌中非常普遍(耐藥率在80%以上)，耐四環(huán)素病原菌的出現(xiàn)嚴(yán)重降低了治療療效。因此，采用更創(chuàng)新的策略是應(yīng)對(duì)四環(huán)素耐藥性危機(jī)重要方法?？股刈魟┎呗酝ㄟ^(guò)抑制細(xì)菌耐藥性或增強(qiáng)抗生素殺傷力來(lái)延長(zhǎng)現(xiàn)有抗生素壽命的方法，是一種有前景的應(yīng)對(duì)耐藥性的策略。

為了探索有效的抗生素組合，本研究測(cè)試了158種美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的多西環(huán)素化合物對(duì)多耐藥(MDR)大腸桿菌的活性。發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作為一種廣泛用作2型糖尿病一線治療的口服降糖藥，能顯著增加強(qiáng)力霉素對(duì)多種tet(A)陽(yáng)性耐藥病原體的活性。進(jìn)一步的研究表明，二甲雙胍會(huì)破壞大腸桿菌的電勢(shì)(Δψ)，并促進(jìn)多西環(huán)素在細(xì)胞內(nèi)的積累，從而克服耐藥性。此外，二甲雙胍可調(diào)節(jié)宿主對(duì)感染的免疫反應(yīng)，包括中性粒細(xì)胞的聚集和炎癥反應(yīng)的緩解。本研究的結(jié)果證明了二甲雙胍作為治療四環(huán)素耐藥細(xì)菌相關(guān)感染的輔助療法的潛力。

研究結(jié)果

1. 二甲雙胍增強(qiáng)四環(huán)素對(duì)耐多藥細(xì)菌的作用

使用tet(A)陽(yáng)性的大腸桿菌作為模型菌株，該菌株對(duì)除替加環(huán)素之外的幾乎所有四環(huán)素都有抗性。通過(guò)監(jiān)測(cè)24小時(shí)內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，測(cè)量了強(qiáng)力霉素與158種FDA批準(zhǔn)的化合物之間的協(xié)同活性。初步篩選確定了15個(gè)化合物與多西環(huán)素對(duì)大腸桿菌具有協(xié)同活性。在這些化合物，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍表現(xiàn)出最有效的協(xié)同作用，抑制率超過(guò)90%，而單獨(dú)的二甲雙胍顯示出較弱的直接抗菌活性(最小抑制濃度(MIC)≥10 mg/mL)。二甲雙胍已廣泛應(yīng)用于臨床治療2型糖尿病。因此，在隨后的研究中關(guān)注二甲雙胍作為四環(huán)素佐劑的潛力。為了確定這種組合是否也適用于其他耐多西環(huán)素的病原體，通過(guò)棋盤(pán)肉湯微量稀釋測(cè)定評(píng)估了二甲雙胍聯(lián)合多西環(huán)素在三種革蘭氏陽(yáng)性菌和兩種革蘭氏陰性菌中的協(xié)同活性。這些病原體攜帶tet(A)基因，對(duì)強(qiáng)力霉素具有表型耐藥性，MIC值為16–32 μg/mL。結(jié)果顯示，二甲雙胍有效地將多西環(huán)素對(duì)這些難以治療的超級(jí)細(xì)菌的活性提高了32-64倍，包括耐粘菌素的大腸桿菌、耐碳青霉烯的腸炎沙門(mén)氏菌和萬(wàn)古霉素-耐藥腸球菌(VRE) (Figure 1)。

Figure 1 二甲雙胍能顯著增強(qiáng)強(qiáng)力霉素對(duì)耐多藥細(xì)菌的活性。

2. 二甲雙胍增強(qiáng)強(qiáng)力霉素療效并減少耐藥性的出現(xiàn)

隨后分別單獨(dú)使用二甲雙胍、強(qiáng)力霉素及同時(shí)使用兩者，對(duì)指數(shù)早期和晚期的細(xì)胞進(jìn)行了時(shí)間-抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，128 μg/mL強(qiáng)力霉素(對(duì)應(yīng)于四倍MIC)或5 mg/mL二甲雙胍均顯示出較弱的殺菌活性。相比之下，強(qiáng)力霉素加二甲雙胍(2 μg/mL+5 mg/mL或32 μg/mL+5 mg/mL)在指數(shù)早期和指數(shù)后期均表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺菌效果(Figure 2a, b)。此外，盡管強(qiáng)力霉素是一種抑菌劑，但高濃度的聯(lián)合治療會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌裂解而起到殺菌作用(Figure 2c)。用二甲雙胍(2.5 mg/mL，對(duì)應(yīng)于MIC的四分之一)在30天里連續(xù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行刺激，結(jié)果并未能獲得抗性突變菌株(Figure 2d)。相比之下，單獨(dú)的強(qiáng)力霉素組產(chǎn)生高耐藥菌株，MIC增加32倍。這些結(jié)果表明，強(qiáng)力霉素和二甲雙胍的組合可以有效地減少?gòu)?qiáng)力霉素耐藥性的重新出現(xiàn)。

Figure 2 強(qiáng)力霉素和二甲雙胍聯(lián)合殺滅病原體的時(shí)間依賴性。

3. 二甲雙胍促進(jìn)強(qiáng)力霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累

考慮到強(qiáng)力霉素的抗菌活性依賴于對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制，因此強(qiáng)力霉素在細(xì)胞內(nèi)的足夠積累對(duì)其活性至關(guān)重要。因此，研究人員假設(shè)二甲雙胍可能促進(jìn)多西環(huán)素的細(xì)胞內(nèi)積累。為了驗(yàn)證猜想，首先通過(guò)熒光強(qiáng)度分析測(cè)試了二甲雙胍對(duì)外膜和細(xì)胞質(zhì)膜通透性的影響。1-N-苯基萘胺(NPN)是一種疏水熒光探針，當(dāng)與磷脂雙層的疏水部分相互作用時(shí)會(huì)釋放熒光，用于監(jiān)測(cè)外膜(OM)的滲透性。結(jié)果顯示，二甲雙胍以劑量依賴性方式增加了大腸桿菌的OM滲透性(Figure 3a)。為了驗(yàn)證二甲雙胍可能導(dǎo)致的細(xì)胞質(zhì)膜功能障礙，DiSC3(5)被用來(lái)評(píng)估細(xì)菌膜電位。將二甲雙胍添加到DiSC3(5)探測(cè)的細(xì)胞中導(dǎo)致三倍增強(qiáng)的熒光，而單獨(dú)的強(qiáng)力霉素對(duì)膜電位損失的影響較弱，表明二甲雙胍破壞了大腸桿菌的電勢(shì)(Δψ) (Figure 3b)。研究表明，膜去極化與活性氧(ROS)和質(zhì)子動(dòng)力(PMF)的產(chǎn)生有關(guān)，因此，進(jìn)一步使用染料DCFH-DA和BCECF-AM探究ROS和PMF的作用。用二甲雙胍處理的大腸桿菌對(duì)ROS積累沒(méi)有影響。與提供葡萄糖的細(xì)菌中PMF增加相比，二甲雙胍導(dǎo)致熒光降低，這意味細(xì)菌中PMF的破壞，因?yàn)镻MF是ATP合成的驅(qū)動(dòng)力(Figure 3c)。在用二甲雙胍處理的大腸桿菌中，細(xì)胞內(nèi)ATP的水平也顯著降低(Figure 3d)?？紤]到PMF對(duì)外排泵的功能至關(guān)重要，接下來(lái)使用溴化乙錠(EtBr)作為熒光探針評(píng)估了暴露于二甲雙胍后細(xì)菌中外排泵的活性。結(jié)果顯示，在與二甲雙胍孵育后，大腸桿菌和MRSA中EtBr的流出減少。通過(guò)LC-MS/MS分析顯示，大腸桿菌中多西環(huán)素的二甲雙胍表現(xiàn)出濃度依賴性積累(Figure 3e)。

Figure 3 強(qiáng)力霉素-二甲雙胍聯(lián)合的協(xié)同作用機(jī)制。

4. 強(qiáng)力霉素和二甲雙胍聯(lián)合使用后大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組分析

RT-PCR分析結(jié)果顯示，用二甲雙胍處理的大腸桿菌中tet(A)的轉(zhuǎn)錄減少(Figure 3F)。為了更深入地了解二甲雙胍的分子機(jī)制并在mRNA水平上誘導(dǎo)基因表達(dá)變化，我們?cè)诒┞队趶?qiáng)力霉素或強(qiáng)力霉素-二甲雙胍4小時(shí)后對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析。與單獨(dú)的強(qiáng)力霉素聯(lián)合治療的比較揭示了663個(gè)上調(diào)和732個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)的下調(diào)(Figure 4a)。GO注釋分析表明，這些DEG與生物過(guò)程(例如，細(xì)胞和代謝過(guò)程)、細(xì)胞成分(細(xì)胞部分)和分子功能(催化活性和結(jié)合)相關(guān)(Figure 4b)。KEGG富集分析表明，這些上調(diào)的DEG在核糖體合成中顯著富集，下調(diào)的DEG參與氧化磷酸化和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Figure 4c, d)。似乎二甲雙胍導(dǎo)致大腸桿菌中多西環(huán)素的細(xì)胞內(nèi)積累，從而抑制蛋白質(zhì)合成，這通過(guò)核糖體合成相關(guān)基因的上調(diào)得到補(bǔ)償。相反，包括ATP合酶和NADH-醌氧化還原酶在內(nèi)的氧化磷酸化相關(guān)基因顯著下調(diào)(Figure 4e)，這與二甲雙胍降低的ATP水平一致(Figure 3d)。值得注意的是，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和多藥外排泵相關(guān)基因急劇下降，這意味著二甲雙胍削弱了大腸桿菌中外排泵的功能?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明二甲雙胍通過(guò)破壞膜電位和外膜通透性(僅在革蘭氏陰性菌中)促進(jìn)強(qiáng)力霉素的細(xì)胞內(nèi)積累，并抑制外排泵的功能。

Figure 4 單獨(dú)使用強(qiáng)力霉素或聯(lián)合使用強(qiáng)力霉素和二甲雙胍后大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄組分析。

5. 二甲雙胍可減輕脂多糖引起的炎癥反應(yīng)

通過(guò)檢測(cè)大腸桿菌的菌落形成單位(CFU)表明，二甲雙胍(5 mg/mL)和強(qiáng)力霉素(256 μg/mL)的補(bǔ)充顯著減少了Vero細(xì)胞中99%的細(xì)菌，說(shuō)明這種組合在消除持久性細(xì)胞內(nèi)病原體方面是有效的(Figure 5a)。研究者接下來(lái)探討了二甲雙胍是否像一些陽(yáng)離子宿主防御肽一樣具有免疫調(diào)節(jié)特性。首先評(píng)估了二甲雙胍在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞毒作用。發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在5 mg/mL時(shí)的細(xì)胞毒性低于10% (Figure 5b)。因此，使用5 mg/mL的劑量來(lái)評(píng)估二甲雙胍的免疫調(diào)節(jié)活性。RAW264.7細(xì)胞用二甲雙胍刺激24小時(shí)后，測(cè)定促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ以及趨化因子IL-8。有趣的是，二甲雙胍選擇性地導(dǎo)致IL-8增加近兩倍，而對(duì)TNF-α、IL-1β和IFN-γ的產(chǎn)生沒(méi)有影響，這意味著二甲雙胍可能會(huì)將中性粒細(xì)胞募集到感染部位(Figure 5c)。接下來(lái)試圖研究二甲雙胍對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。脂多糖(LPS)用于模擬細(xì)菌病原體誘導(dǎo)的炎癥。在LPS刺激巨噬細(xì)胞之前外源性添加二甲雙胍可顯著抑制四種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(Figure 5d)。這些結(jié)果共同表明，二甲雙胍不僅通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)抗生素的積累特異性地增強(qiáng)了強(qiáng)力霉素的活性，而且還調(diào)節(jié)了針對(duì)感染的免疫反應(yīng)(Figure 5e)。

Figure 5 二甲雙胍在根除耐藥病原菌中對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用。

6. 二甲雙胍逆轉(zhuǎn)多西環(huán)素耐藥性的體內(nèi)效果

接下來(lái)評(píng)估了這些作用是否會(huì)在動(dòng)物感染模型中產(chǎn)生積極的結(jié)果。構(gòu)建了G. mellonella幼蟲(chóng)感染模型并將其用于評(píng)估感染模型中強(qiáng)力霉素和二甲雙胍組合的對(duì)體內(nèi)耐藥大腸桿菌或MRSA感染的功效。對(duì)照組的幼蟲(chóng)在72小時(shí)內(nèi)全部死亡，而單用強(qiáng)力霉素或二甲雙胍組的存活率低于30%。與強(qiáng)力霉素給藥組相比，聯(lián)合組幼蟲(chóng)的存活率顯著提高(p=0.0034)，感染后120小時(shí)存活率達(dá)到80% (Figure 6a)。同樣，在小鼠腹膜炎感染模型中也觀察到聯(lián)合療法的預(yù)期體內(nèi)療效。強(qiáng)力霉素加二甲雙胍治療比強(qiáng)力霉素組獲得了生存獲益(p=0.025) (Figure 6b)。最后，我們?cè)诟腥靖锾m氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌的中性粒細(xì)胞減少小鼠大腿感染模型中測(cè)試了聯(lián)合療效。與強(qiáng)力霉素單藥治療相比，強(qiáng)力霉素和二甲雙胍(50+10 mg/kg)的聯(lián)合治療顯示CFU減少約2-log10。較高濃度的組合(50+50 mg/kg)表現(xiàn)出更有效的CFU減少(高于3-log10) (Figure 6c)。這些體內(nèi)有效結(jié)果證明了二甲雙胍與強(qiáng)力霉素在治療由耐藥病原體生長(zhǎng)引起的細(xì)菌感染性疾病方面的潛力。

Figure 6 二甲雙胍在體內(nèi)恢復(fù)強(qiáng)力霉素的敏感性。

研究結(jié)論

綜上所述，二甲雙胍具有多種用途，二甲雙胍是一種很有前景的四環(huán)素佐劑，且具有良好的安全性、良好的臨床表型，可用于治療致病菌引發(fā)的感染。同時(shí)，二甲雙胍的鑒定鼓勵(lì)我們發(fā)現(xiàn)更多具有協(xié)同機(jī)制的候選抗生素佐劑。

參考文獻(xiàn)

"Metformin Restores Tetracyclines Susceptibility against Multidrug Resistant Bacteria."

Adv. Sci. 2020, 7, 1902227

DOI: 10.1002/advs.201902227