背景及概述[1]
alpha-淀粉酶即α-淀粉酶，廣泛存在于生物界。alpha-淀粉酶能夠催化隨機水解淀粉的 α?1，4?糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、麥芽三糖和α糊精。alpha-淀粉酶廣泛應(yīng)用于飴糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和醫(yī)藥等行業(yè)。
制備[1]
（1）載體pxmj19-aph213的制備。
載體pxmj19-aph213的構(gòu)建過程如下：
以引物aph213F和aph213R從載體xk99e載體上擴增出aph213基因，所用的引物如下：
aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac
aph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg
PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃ 7min。
上述引物的設(shè)計使得aph213基因擴增過程中，在aph213基因上游形成EcoRV切點、下游形成HindIII 切點，aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；回收PCR產(chǎn)物并以EcoRV和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經(jīng)過EcoRV和HindIII酶切的載體pxmj-19上，獲得載體pxmj19-aph213。
載體pxmj19-aph213的擴增過程如下：
a、在50ml離心管中加入3ml的LB培養(yǎng)基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；
b、挑取帶有載體pxmj19-aph213的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基中，在37℃，230rpm的條件下培養(yǎng)12h，以擴增pxmj19-aph213質(zhì)粒；
c、根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒的說明書提取pxmj19-aph213質(zhì)粒。
（2）枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因的擴增與改造。
以引物AmyF和AmyR從枯草芽孢桿菌的基因組上擴增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：
AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；
AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；
PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃7min。
上述引物的設(shè)計使得α-淀粉酶基因擴增過程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成組氨酸標簽，上游酶切位點為HindIII，下游酶切位點為XhoI；
（3）構(gòu)建重組載體。
回收PCR產(chǎn)物并用XhoI和HindIII酶切，通過T4DNA連接酶，連接到同樣經(jīng)過XhoI和HindIII酶切的載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達載體pxmj19-aph213-amy。
（4）構(gòu)建重組菌。
將重組表達載體pxmj19-aph213-amy轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行預(yù)擴增，培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，氯霉素濃度為50ug/ml；提取后，用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中，在LBHIS恢復(fù)培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，氯霉素濃度為30ug/ml。
（5）培養(yǎng)重組菌，分泌表達α-淀粉酶。
將長出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BHI培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為30℃，230rpm，48h。
（6）α-淀粉酶的純化。
a、將重組菌的培養(yǎng)物進行離心，12000rpm、4℃、5min，獲得含有α-淀粉酶的上清。
b、將含有α-淀粉酶的上清進行親和層析，首先用緩沖液A平衡鎳柱，將含有α-淀粉酶的上清過濾并上樣至平衡后的鎳柱，繼續(xù)用緩沖液A平衡至基線水平后繼續(xù)平衡3個柱體積；用100mmol的B液洗脫，收集洗脫的洗脫液，每管收集0.5ml；
緩沖液A為：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的緩沖液，緩沖液B為：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的緩沖液。
c、對含有α-淀粉酶的洗脫液通過脫鹽柱進行脫鹽，獲得純化的α-淀粉酶溶液，-20℃保存；
脫鹽用的緩沖液為50mM的PBS緩沖液，pH為7.0。
參考文獻
[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201610836135.0 α-淀粉酶的制備方法【公開】/α-淀粉酶的制備方法【授權(quán)】