背景及概述^[1-2]

基因敲除亦稱基因剔除。依據(jù)DNA同源重組原理建立，用以推測基因功能的技術(shù)。該技術(shù)對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計實驗，應(yīng)用基因打靶方法，將該基因完全去除、修飾或用其他序列相似基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)的基因功能?；蚯贸齽游锬Ｐ捅粡V泛地應(yīng)用于研究與營養(yǎng)素代謝、生物轉(zhuǎn)化和生物學(xué)功能相關(guān)的基因及其功能，以及營養(yǎng)失調(diào)相關(guān)疾病的發(fā)病機制等。

步驟^[3]

基因敲除的一般流程見圖

基本程序是：用PCR技術(shù)擴增目的基因序列，在體外插入卡拉霉素、四環(huán)素等受體菌原先不具有的抗性標記，使目的基因失活，再將失活的目的基因構(gòu)建至一環(huán)狀載體上，用電轉(zhuǎn)化、顯微注射等方法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化入受體細胞內(nèi)，以抗性標記初步篩選陽性菌或進行目的基因功能的失活檢測，再以PCR，southern雜交等做進一步驗證。

現(xiàn)在，為了更好地區(qū)別單交換與雙交換造成的重組，通常使用兩個抗性標記，在發(fā)生單交換時，陰性和陽性抗性標記都會整合至基因組，而發(fā)生雙交換時，第二次同源重組會導(dǎo)致基因回復(fù)至野生型或敲除目的基因，在前一種情況下，兩種標記都不存在；在后一種情況下，基因組上只有陽性標記，因此這樣的敲除子可以通過正負篩選鑒別出。但如果載體構(gòu)建時在同源序列內(nèi)部引入一些突變，就不會回復(fù)至野生型，這樣，既能實現(xiàn)基因的失活，基因組上又不會帶有抗性標記，這對構(gòu)建“食品級”的安全菌株是有益的。在了解微生物代謝途徑相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建合適的敲除載體，利用微生物原有原因與構(gòu)建的同源重組系統(tǒng)發(fā)生交換，進行代謝旁路的阻斷，防止副產(chǎn)物或有毒產(chǎn)物的形成，促進目的產(chǎn)物積累，從而達到調(diào)節(jié)代謝流，優(yōu)化代謝途徑的目的?；蚯贸夹g(shù)既對敲除載體的要求不高可用于原核細胞，也可用于真核細胞，用途廣泛。

策略選擇^[3]

基因敲除過程中，敲除載體的設(shè)計及構(gòu)建是非常重要的。同時，在載體構(gòu)建的過程中要考慮建立合理、可靠的篩選方法。同源重組的效率較低，故對重組子的篩選和檢測是基因敲除的關(guān)鍵步驟。目前根據(jù)不同的目的和要求，因敲除的策略主要有以下幾種。

1. 非復(fù)制型質(zhì)粒載體敲除法

對野生菌做基因敲除，可以先考慮用非復(fù)制型載體。由于構(gòu)建好的敲除載體在受體菌中是不復(fù)制的，因此轉(zhuǎn)化之后，在選擇壓力下，未發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子由于敲除載體不能復(fù)制隨著菌體生長而被稀釋。利用在地中海擬無枝菌酸菌中不復(fù)制的敲除質(zhì)粒PDK110，成功地用α-淀粉酶基因取代了地中海擬無枝菌酸菌U32染色體上的3-氨基-5-羥基苯甲酸合成酶基因。此法的主要缺點是整合幾率低，需要數(shù)千堿基的同源序列，且對受體菌的感受態(tài)效率要求較高。

2. 不穩(wěn)定型質(zhì)粒載體敲除法

若受體菌感受態(tài)較難制備，可考慮采用不穩(wěn)定型敲除載體。例如：2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)是維生素C合成的重要前體，但發(fā)現(xiàn)存在高水平的2-酮基醛糖還原酶(2-KR)活力。由于2-KR能夠利用NADPH或NADH輔酶將Vc生產(chǎn)菌代謝中重要的中間產(chǎn)物2，5-二酮基-D-葡萄糖酸(2，5-DKG)及2-KLG轉(zhuǎn)化為其他副產(chǎn)物，將失活的2-KR基因構(gòu)建到pBR322衍生質(zhì)粒上，這種質(zhì)粒在受體菌中分配不穩(wěn)定，在無壓力選擇或低磷條件下培養(yǎng)5～10代會出現(xiàn)很多質(zhì)粒丟失的細胞。因此轉(zhuǎn)化后可先控制培養(yǎng)條件使敲除載體隨細胞復(fù)制以增加轉(zhuǎn)化子的數(shù)目，然后再在無壓力選擇或低磷條件下讓質(zhì)粒丟失，最后在選擇壓力下篩選敲除子。目前已成功敲除2-KR基因。

3.溫度敏感型(Ts型)質(zhì)粒載體敲除法

1993年利用Ts型質(zhì)粒建立了革蘭氏陽性菌高效的基因敲除系統(tǒng)。Biswas所用質(zhì)粒pG+host5在37℃時不復(fù)制，而28℃時以滾環(huán)模式進行復(fù)制。因此轉(zhuǎn)化后在選擇壓力下37℃培養(yǎng)會導(dǎo)致次同源重組sco(single-crossover)，之后將溫度降至28℃，會促使質(zhì)粒發(fā)生滾環(huán)復(fù)制，這種復(fù)制機制會導(dǎo)致發(fā)生第二次重組dco(double-crossover)。重組后，目的基因或是被敲除，或是回復(fù)成野生型。由于使用了Ts型質(zhì)粒，因此轉(zhuǎn)化后可先在復(fù)制溫度下培養(yǎng)促進轉(zhuǎn)化子的生長及繁殖。即使外界無抗性選擇壓力重組機率也會增加。該技術(shù)可避免使用抗生素抗性標記，可用于構(gòu)建“食品安全級”的菌株。由于質(zhì)粒是以滾環(huán)機制復(fù)制，重組效率高。Biswas的研究表明在有抗性選擇壓力時，50%以上的菌發(fā)生了替換重組；無抗性選擇壓力時，替換重組的效率為1%～40%。此外，Ts型質(zhì)粒宿主譜廣，可在很多革蘭氏陽性菌中使用。

4.線形轉(zhuǎn)化敲除法

1998年報道了利用λ噬菌體的線性Red同源重組系統(tǒng)獲得高重組率。Red系統(tǒng)主要包含3種蛋白質(zhì)分子，分別稱為Exo、Beta和Gam。Exo蛋白具有DNA外切核酸酶活性，從雙鏈DNA末端按5'※3'的方向消化單鏈DNA。Beta蛋白可結(jié)合在由Exo消化產(chǎn)生的3'單鏈DNA末端，促進該單鏈DNA末端與互補鏈退火和體內(nèi)重組。

Gam抑制宿主菌的重組蛋白RecBCD的線性雙鏈DNA外切酶活性，協(xié)助Exo和Beta完成同源重組。Red系統(tǒng)相對于宿主菌來說是一個外來的功能單位，因此必須對其表達進行調(diào)控。將部分λ噬菌體的基因整合至E.coli染色體上，exo，beta和gam3個基因受C2857阻遏蛋白的調(diào)控表達；將Red系統(tǒng)構(gòu)建在一個以arac-ParaB為啟動子的Ts型質(zhì)粒上，在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下可進行有效表達，而在溫度控制下可快速去除此質(zhì)粒。利用此類質(zhì)?？焖偾贸肆〖矖U菌中的asd基因，之后又利用編碼FLP重組酶的Ts型輔助質(zhì)粒去除了抗性基因，為Red系統(tǒng)在E.coli以外的微生物中的應(yīng)用進行了嘗試。

應(yīng)用^[2]

基因敲除作為近幾十年新興的一種重要的重組DNA技術(shù)，在微生物代謝工程研究中，利用λ噬菌體的Red系統(tǒng)在細菌中進行的基因敲除技術(shù)和PCR介導(dǎo)的酵母基因中斷技術(shù)，廣泛應(yīng)用于構(gòu)建具有特定突變的工程菌，改變生物代謝途徑，阻斷副反應(yīng)的進行，防止副產(chǎn)物或有毒產(chǎn)物形成，促進目的產(chǎn)物積累等方面；在生物醫(yī)學(xué)研究中，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于真核生物體內(nèi)，操縱著許多細胞功能，如參與了細胞正常的生長、發(fā)育調(diào)控，穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子，同時調(diào)控機體抵御外病毒的入侵。

主要參考資料

[1] 營養(yǎng)科學(xué)詞典

[2] 基因敲除技術(shù)研究進展

[3] 基因敲除技術(shù)及其在微生物代謝工程方面的應(yīng)用