背景[1-3]
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒是一種通過酶聯(lián)免疫技術(shù)（Elisa）原理特異性識(shí)別樣本中人鈣結(jié)合蛋白(CR)的商品化試劑盒。人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒可以通過識(shí)別樣本中人NOD樣受體(NLR)的類別及含量為科研及臨床診斷提供依據(jù)。
需要注意的是若用于臨床診斷的Elisa試劑盒需取得上市所在國的醫(yī)療器械資質(zhì)。同時(shí)人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒的診斷結(jié)論存在一定的局限性，受限于樣本保存不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，方法學(xué)靈敏度等原因不能作為臨床判斷的唯一依據(jù)。
鈣結(jié)合蛋白（calcium-binding protein），多種具有結(jié)合鈣離子能力的特殊蛋白質(zhì)的總稱，為一些特異性、具高親和力或高親和量、能可逆地與鈣相結(jié)合的蛋白質(zhì)。如腸道吸收鈣與鈣結(jié)合的蛋白質(zhì)、腎臟吸收鈣與鈣結(jié)合的蛋白質(zhì)，肌肉結(jié)合鈣的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)代謝的鈣調(diào)蛋白，甚至淀粉酶、嗜熱菌蛋白質(zhì)等。
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒技術(shù)原理：ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法:
1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒操作流程如下:
(1)待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl,每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔;設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μl。
(2)酶標(biāo)板置4℃,包被過夜。
(3)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。
(4)陰性對(duì)照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的抗體工作液50μl。
(5)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
(6)洗板,同(4)。
(7)每孔加1:5000稀釋的抗體工作液100μl。
(8)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
(9)洗板,同(4)。
(10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應(yīng)15-20min。
(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。
(12)分別測(cè)450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,測(cè)得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
(13)數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的OD值后,計(jì)算S/N值。
應(yīng)用[4][5]
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒可以用于基于耳蝸核鈣結(jié)合蛋白含量的變化探討復(fù)聰片延緩老年C57BL/6J小鼠聽力下降的實(shí)驗(yàn)研究
通過觀察耳蝸核(CN)鈣結(jié)合蛋白含量的變化探討復(fù)聰片延緩老年C57BL/6J小鼠聽力下降的可能機(jī)制,為復(fù)聰片防治老年性耳聾提供理論依據(jù)。
方法:6月齡C57BL/6J小鼠24只經(jīng)ABR檢測(cè)后隨機(jī)分為2組,復(fù)聰片治療組與老年空白組,分別喂養(yǎng)含復(fù)聰片的飼料、普通飼料6月。喂養(yǎng)結(jié)束取材時(shí)選取1月齡C57BL/6J小鼠12只作為青年空白組。各組動(dòng)物通過聽性腦干反應(yīng)測(cè)聽(ABR)評(píng)價(jià)聽力情況;通過尼氏染色、免疫組化(IHC)及人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒觀察三組小鼠CN神經(jīng)元中尼氏體、鈣結(jié)合蛋白(PV、CR、CB)的表達(dá)情況。
人鈣結(jié)合蛋白(CR)Elisa試劑盒結(jié)果:1、青年空白組(1月齡)小鼠的平均聽閾明顯低于老年空白組(6月齡)及(12月齡),1月齡與6月、12月齡兩者的聽閾差異均具有顯著性差異(P<0.01)。12月齡老年空白組與復(fù)聰片治療組小鼠均出現(xiàn)不同程度的聽閾升高,老年空白組升高更明顯,兩組聽閾比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2、青年空白組與老年空白組比較:老年空白組CN神經(jīng)元中尼氏體、CB、CR含量較青年空白組均明顯下降,PV含量較青年空白組升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且尼氏體、CB具有顯著性差異(P<0.01)。3、復(fù)聰片治療組與老年空白組比較:復(fù)聰片治療組CN神經(jīng)元中尼氏體、CB、CR含量高于老年空白組,PV低于老年空白組,兩組中僅尼氏體、CB含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CR、PV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論:老年C57BL/6J小鼠聽力下降伴隨著耳蝸核神經(jīng)元的損傷及CB、CR的下降、PV的升高。復(fù)聰片能有效延緩其聽力下降,作用機(jī)制可能與復(fù)聰片抑制了鈣結(jié)合蛋白D-28K(CB)的減少,延緩了耳蝸核神經(jīng)元的衰退有關(guān)。
參考文獻(xiàn)
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