基因敲除是自80年代末以來發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA ，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的。

實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法

1.利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除

基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA 同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法。

(1)利用同源重組構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型的基本步驟：

①. 基因載體的構(gòu)建：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo 基因，TK 基因等)的載體上，成為重組載體?；蚯贸菫榱耸鼓骋换蚴テ渖砉δ?，所以一般設(shè)計(jì)為替換型載體。

②.ES 細(xì)胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。常用的鼠的種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。而其他遺傳背景的胚胎干細(xì)胞系也逐漸被發(fā)展應(yīng)用。

③.同源重組：將重組載體通過一定的方式(電穿孔法或顯微注射)導(dǎo)入同源的胚胎干細(xì)胞(ES cell)中，使外源DNA 與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA 序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)。一般地，顯微注射命中率較高，但技術(shù)難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便于使用。

④.選擇篩選已擊中的細(xì)胞：由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率為10-2 ～10-5 ，植物的概率為10-4 ～10-5 。因此如何從眾多細(xì)胞中篩出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選法(PNS法)，標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及PCR 法。其中應(yīng)用最多的是PNS法。

⑤.表型研究：通過觀察嵌和體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對(duì)小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。

⑥.得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對(duì)染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。

2 條件性基因敲除法

條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。

條件性敲除的原理

利用Cre/LoxP 和來自酵母的FLP—frt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細(xì)胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型[7]。通過常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點(diǎn)上裝上兩個(gè)同向排列的1oxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP 的(“loxP floxed”)ES 細(xì)胞產(chǎn)生“loxPfloxed”小鼠,然后，通過將“loxP floxed”小鼠與Cre 轉(zhuǎn)基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠。在“loxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個(gè)loxP，但靶基因并沒有發(fā)生其他的變化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣。但當(dāng)它與Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時(shí)，產(chǎn)生的子代中將同時(shí)帶有“loxP floxed”靶基因和Cre 基因。Cre 基因表達(dá)產(chǎn)生的Cre 重組酶就會(huì)介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的1oxP 間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個(gè)loxP 和靶基因切除。這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre 的表達(dá)為前提的。Cre 的表達(dá)特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre 在哪一種組織細(xì)胞中表達(dá)，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞;而Cre 的表達(dá)水平將影響靶基因在此種組織細(xì)胞中進(jìn)行修飾的效率。所以只要控制Cre 的表達(dá)特異性和表達(dá)水平就可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

(3)誘導(dǎo)性基因敲除法

誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制或利用Cre 基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP 動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。常見的幾種誘導(dǎo)性類型如下：四環(huán)素誘導(dǎo)型;干擾素誘導(dǎo)型;激素誘導(dǎo)型;腺病毒介導(dǎo)型。

誘導(dǎo)性基因敲除優(yōu)點(diǎn)：

① 誘導(dǎo)基因突變的時(shí)間可人為控制;

② 可避免因基因突變而致死胎的問題

③ 在2 個(gè)loxP 位點(diǎn)之間的重組率較高;

④如用病毒或配體/DNA 復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre 的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過程。[10]

2.2利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除。

2.2.1 原理：

此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞(原理見圖5)[11,12] 。根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞的插入;對(duì)于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用;噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除。

2.2.2基因捕獲法

基因捕獲法是最近發(fā)展起來的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法，其原理可見圖6。通?；虿东@載體還包括一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES 克隆可以很容易地在含G418 的選擇培養(yǎng)基中篩選出來，從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100%地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得[13]

2.2.3基因捕獲法的優(yōu)缺點(diǎn)

用常規(guī)方法進(jìn)行基因敲除研究需耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力，研究者必須針對(duì)靶位點(diǎn)在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，繪制相應(yīng)的物理圖譜，構(gòu)建特異性的基因敲除載體以及篩選中靶ES 細(xì)胞等，通常一個(gè)基因剔除純合子小鼠的獲得需要一年或更長的時(shí)間。面對(duì)人類基因組計(jì)劃產(chǎn)生出來的巨大的功能未知的遺傳信息，傳統(tǒng)的基因敲除方法顯得有些力不從心。因此，基因捕獲法應(yīng)運(yùn)而生，利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES 細(xì)胞庫，節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用，更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。

此方法的缺點(diǎn)是只能剔除在Es 細(xì)胞中表達(dá)的基因.單種的細(xì)胞類型中表達(dá)的基因數(shù)目約為I04，現(xiàn)在的基因捕獲載體從理論上來講應(yīng)能剔除所有在ES細(xì)胞表達(dá)的基因，因此，在ES 細(xì)胞中進(jìn)行基因捕獲還是大有可為的。用基因捕獲法進(jìn)行基因剔除的另一個(gè)缺點(diǎn)是無法對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾，

2.3.RNAi引起的基因敲除。

由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中,所以RNAi的反應(yīng)過程也可以用于基因敲除。近年來，越來越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡單方便的方法。

2.3.1 RNAi阻斷基因表達(dá)的機(jī)理

雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP (以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶RNA-directed RNApolymerase，RdRP)的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白。此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。從21到23個(gè)核苷酸的siRNA到幾百個(gè)核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA。

2.3.2 RNAi基因敲除的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用

①.比用同源重組法更加簡便，周期大大縮短。

②.對(duì)于哺乳動(dòng)物，如對(duì)于一些敲除后小鼠在胚胎時(shí)就會(huì)死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。

③.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，它成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。

④.RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達(dá)，來研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。

2.4實(shí)現(xiàn)基因敲除的其他原理。

除上述幾種已經(jīng)比較成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，還有一些基于其他原理的敲除技術(shù)正處于研究和完善過程中，如TFOs(Triple helix forming oligonucleotides)引導(dǎo)的基因敲除術(shù)[16]以及反義技術(shù)在基因敲除技術(shù)中的運(yùn)用等[17]。隨著遺傳學(xué)，分子生物學(xué)理論的發(fā)展，新的基因敲除原理也在不斷的發(fā)現(xiàn)和發(fā)掘中。

基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及前景

①.建立生物模型。在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要?；蚯贸夹g(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細(xì)胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。最常見的是小鼠，家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見于報(bào)道。

②.疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療。通過基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響。這無論是對(duì)了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義。

③.提供廉價(jià)的異種移植器官。眾所周知，器官來源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。這是因?yàn)楫愒瓷锏幕驎?huì)產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來具大的福音。如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α-1，3GT 基因。使每只豬都缺乏產(chǎn)生a1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的2個(gè)拷貝。這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)。在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應(yīng)即不會(huì)再發(fā)生。

④.免疫學(xué)中的應(yīng)用。同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì)有一定的免疫排斥，使得人用抗體類藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻。而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的相應(yīng)基因，那么將產(chǎn)生人的抗體，從而解決人源抗體的生產(chǎn)問題。

⑤改造生物、培育新的生物品種。細(xì)菌的基因工程技術(shù)是本世紀(jì)分子生物學(xué)史上的一個(gè)重大突破，而基因敲除技術(shù)則可能是遺傳工程中的另一重大飛躍。它為定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技術(shù)支持。

4.基因敲除技術(shù)的缺陷

隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的，敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T可以提供同樣的功能;另一方面，對(duì)于某些必需基因，敲除后會(huì)造成細(xì)胞的致死性，也就無法對(duì)這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究了。