背景^[1-3]

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒是一種通過酶聯(lián)免疫技術（Elisa）原理特異性識別樣本中大鼠抑瘤素M(OSM)的商品化試劑盒。大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒可以通過識別樣本中大鼠抑瘤素M(OSM)的類別及含量為科研及臨床診斷提供依據(jù)。

需要注意的是若用于臨床診斷的Elisa試劑盒需取得上市所在國的醫(yī)療器械資質(zhì)。同時大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒的診斷結(jié)論存在一定的局限性，受限于樣本保存不當、實驗操作不規(guī)范，方法學靈敏度等原因不能作為臨床判斷的唯一依據(jù)。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒技術原理：方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒操作流程如下:

(1)待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設3個平行孔;設兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液100μl;另設一個空白對照孔,加入純細胞裂解液100μl。

(2)酶標板置4℃,包被過夜。

(3)洗板:吸干孔內(nèi)反應液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復洗滌3-4次。

(4)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的抗體工作液50μl。

(5)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀釋的抗體工作液100μl。

(8)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應。

(12)分別測450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,測得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

(13)數(shù)據(jù)處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的OD值后,計算S/N值。

應用^[4][5]

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒可以用于抑瘤素M與哮喘大鼠氣道重塑的關系研究

觀察抑瘤素M在哮喘大鼠氣道壁中的表達,探討抑瘤素M的表達與哮喘氣道重塑的關系,為哮喘的防治尋找可能的靶點。

方法：選用30只Wistar雄性健康大鼠,鼠齡8W,體重200-220g。將30只Wistar大鼠隨機分為二組：對照組和哮喘組。第一天哮喘組用用抗原混懸液2m1(含卵白蛋白100mg,氫氧化鋁200mg、滅活百日咳桿菌菌苗6×109個)腹腔注射致敏。第15天開始1%卵白蛋白溶液霧化激發(fā),每天一次,每次20—30分鐘,共8W,建立哮喘模型。對照組第一天用第1天用生理鹽水2m1腹腔注射,第15天開始用生理鹽水霧化吸入,余同哮喘組。末次激發(fā)結(jié)24小時后,取各只大鼠的支氣管肺泡灌洗液行嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞,淋巴細胞的分類計數(shù)。采取肺組織標本,采用HE染色觀察氣道形態(tài)學改變；采用免疫組化染色和大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒檢測并經(jīng)計算機圖像分析測定氣道壁中Oncostatin M蛋白表達水平；同時采用RT-PCR法測定肺組織中Oncostatin M mRNA的表達。

大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒結(jié)果：(1)哮喘組大鼠支氣管肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞浸潤數(shù)為(9.21±1.24)與正常對照組比較(0.71±O..01),明顯增加,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而哮喘組大鼠支氣管肺泡灌洗液巨噬細胞、中性粒細胞,淋巴細胞浸潤數(shù)分別為(64.81±2.52)(11.52±2.02)(13.24±2,36)],與正常對照組[(80.19±2.02)(9.14±2.57)(10.54±1.50)]比較,差異具無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。病理證實哮喘模型基本成功。(2)哮喘組大鼠總管壁厚度(WAt/Pbm),氣管內(nèi)壁厚度(WAi/Pbm)及平滑肌層厚度(WAm/Pbm)分別為[(132.06±6.13)(81.52±1.55)(43.71±5.67)],與正常對照組[(79.84±2.40)(61.12±3.81)(16.78±2.13)]比較,顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05。(3)哮喘組肺組織中抑瘤素mRNA表達為(0.95±0.04),高于正常對照組的(0.45±0.16),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(4)抑瘤素M大鼠抑瘤素M(OSM)Elisa試劑盒高表達及免疫組化染色陽性細胞表達強度,哮喘組(0.34±0.13)明顯強于對正常對照組大鼠(0.15±0.05),差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(5)氣管壁抑瘤素M水平與哮喘組大鼠總管壁厚度,氣管內(nèi)壁厚度,平滑肌層厚度呈正相關(R值分別為0.768、0.532、0.745,P均<0.05),對照組無相關性(R值分別為-0.135、-0.308、-0.325,P均>0.05)。(6)哮喘組嗜酸性粒細胞數(shù)與抑瘤素M水平正相關,(R=0.970,P=0.000),而中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)與抑瘤素M水平無相關(R值分別為0.020、0.180、-0.256,P均>0.05)。

參考文獻

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