背景及概述^[1]

維生素K2生物合成途徑是由異戊二烯側(cè)鏈合成途徑與萘醌骨架合成途徑組合而成的。維生素K2具有良好的促進(jìn)凝血、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的功效，同時還能改善動脈硬化，對肝癌和白血病也有預(yù)防和治療作用，早在1995年日本已經(jīng)將維生素K2作為骨質(zhì)疏松治療藥物。

制備^[1-2]

報道一、

（1）以黃桿菌1.6859為出發(fā)菌株，將黃桿菌培養(yǎng)在如下平板培養(yǎng)基（g/L）中進(jìn)行活化：葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，PH自然；溫度37℃，培養(yǎng)時間3天；

（2）將活化好的菌種用無菌生理鹽水稀釋100倍，達(dá)到菌液中菌體濃度為每毫升含107個細(xì)胞，用微量移液器取該菌懸液0.1mL均勻涂布于無菌平皿上，置于超凈工作臺上自然風(fēng)干，將平皿放入低能離子注入機(jī)的靶室中進(jìn)行N+注入，注入能量為15kev，劑量為2.0×1015N+/cm2；同時以真空環(huán)境下未接受離子注入的樣品作為對照；離子注入輻照后，在超凈工作臺上用1mL無菌生理鹽水分別洗脫處理樣品和對照樣品，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1mL菌液均勻涂布在初篩平板培養(yǎng)基（葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，1,4?二羥基?2?萘甲酸80mg/L）上培養(yǎng)，在35℃下倒置培養(yǎng)3天，待長出單菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發(fā)酵培養(yǎng)基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上搖瓶發(fā)酵，將維生素K2產(chǎn)量高的菌株移至斜面培養(yǎng)基保藏；

（3）將上步驟獲得高產(chǎn)量黃桿菌菌液取0.1mL于無菌空平皿中涂布均勻，吹干；將平皿放入低溫空氣等離子體放電裝置中，抽真空到30Pa時開始等離子體放電，電源為13.56MHz的射頻電源，功率為360W，放電20分鐘后放入過濾后的無菌空氣恢復(fù)柜內(nèi)壓力，取出樣品；同時以真空條件下不接受等離子體放電處理的真空對照和未處理對照；在超凈工作臺上用1mL無菌生理鹽水分別洗脫處理樣品和對照樣品，將洗脫得到的菌液用微量移液器分別取0.1mL菌液均勻涂布在初篩平板培養(yǎng)基（葡萄糖15g/L，馬鈴薯浸出液180g/L，甘油5g/L，瓊脂20g/L，1,4?二羥基?2?萘甲酸80mg/L）上培養(yǎng)，在35℃下倒置培養(yǎng)3天，待長出單菌落后進(jìn)行菌落計數(shù)并挑取生長速度快，直徑大的菌落，接入發(fā)酵培養(yǎng)基（甘油10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物1.5g/L，MgSO40.3g/L，K2HPO44.5g/L，NaCl3g/L）上搖瓶發(fā)酵；反復(fù)步驟（2）和步驟（3）2次后，獲得黃桿菌菌株維生素K2產(chǎn)量提高80%；

（4）將步驟（3）獲得的黃桿菌菌株接入種子培養(yǎng)基（甘油10g/L，蛋白胨20g/L，MgSO41.5g/L，K2HPO41.5g/L）中在35℃培養(yǎng)1天，按接種量5%接入發(fā)酵培養(yǎng)基，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2%表面活性劑POE，胞內(nèi)維生素K2可溶至胞外；然后搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)，35℃培養(yǎng)3天，維生素K2總產(chǎn)量提高150%。

報道二、

（1）取黃桿菌HNA12-D接種于斜面培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)24小時進(jìn)行活化，然后置于4℃下保藏2天，獲得活化的黃桿菌HNA12-D的斜面保藏菌，所述斜面培養(yǎng)基的配方為：甘油8g/L，蛋白胨8g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.1g/L，瓊脂20g/L；

（2）取上述斜面保藏菌接種于種瓶培養(yǎng)基中，每50mL種瓶培養(yǎng)基接種0.1立方厘米的斜面保藏菌，在30℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24小時，搖瓶轉(zhuǎn)速120rpm，獲得種瓶培養(yǎng)物，所述種瓶培養(yǎng)基配方為：甘油4g/L，蛋白胨4g/L，酵母提取物1.5g/L，氯化鈉2g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.05g/L；

（3）取種瓶培養(yǎng)物接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于28℃下發(fā)酵培養(yǎng)120小時，獲得發(fā)酵液，每100ml發(fā)酵培養(yǎng)基接種4ml的種瓶培養(yǎng)物，發(fā)酵培養(yǎng)期間每隔20小時補(bǔ)加營養(yǎng)物質(zhì)的重量百分比分別為：甘油0.05%、蛋白胨0.05%以及異戊二烯0.005%，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：在上述種瓶培養(yǎng)基中添加聚氧乙烯油醚0.5g/L；

（4）取上述發(fā)酵液，加入明礬進(jìn)行絮凝，離心，收集沉淀，獲得濕菌體；

（5）將濕菌體放在-15℃低溫下冷凍3分鐘，然后在室溫中融化；

（6）重復(fù)上述步驟（5）2次，使?jié)窬w的細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融而破碎，獲得破碎菌體；

（7）純化：

a、用20mL正己烷對上述破碎菌體進(jìn)行萃取，提取有機(jī)層并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到維生素K2粗品；

b、取維生素K2粗品，溶于5mL無水乙醇中，用溶脹好的HZ816樹脂裝柱30mL，連接紫外檢測器和收集器，以3BV/h的流速將維生素K2粗品溶液倒入層析柱上，然后用100%工業(yè)乙醇對樹脂進(jìn)行洗脫，洗脫至紫外檢測器所示數(shù)值恒定不變，此時大部分雜質(zhì)基本被洗脫干凈了，再用丙酮溶液將維生素K2洗脫下來，獲得的丙酮洗脫液置于0℃下靜置，即得到維生素K2粗分品；

c、將適量的硅膠裝入層析柱中，硅膠裝入層析柱的高徑（直徑）比為3：1，取維生素K2粗分品溶于體積比為10：1的正己烷和乙酸乙酯混合液的洗脫劑中，從層析柱頂端倒入，在柱子下端收集流出液，其中洗脫的流速為0.5BV/h；

（8）將上述純品提取液干燥，獲得維生素K2的純品。

參考文獻(xiàn)

[1][中國發(fā)明]CN201310280268.0一種利用黃桿菌高效生產(chǎn)維生素K2的方法

[2][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)]CN201310521459.1一種維生素K2及其制備方法