背景[1-4]
高純質粒小提試劑盒用于高純度質粒DNA的小量制備與純化。菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低pH處理，質粒可從菌體中釋放出來，并特異、高效地被離心柱硅膠膜（Spin Columns PA）吸附。通過去蛋白液（Buffer PD）和漂洗液（Buffer PW）的清洗可去除蛋白及其他雜質，在低鹽、高pH條件下洗脫，最后得到高純度的質粒DNA。
使用本試劑盒可從1~5 ml過夜培養(yǎng)的菌液中純化得到高達20 ug的高純度質粒DNA，可在30 min之內完成提取任務。所得質?？芍苯佑糜诿盖?、轉化、PCR、測序、低敏感細胞株的轉染等各種常規(guī)分子生物學操作。
產(chǎn)品特點：
1.快速：步驟少，操作簡便，節(jié)約時間。
2.簡便：離心吸附柱不需要預平衡，漂洗液Buffer PW和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即開即用。
3.純度高：所得質?？芍苯佑糜诿盖?、轉化、PCR、測序、低敏感細胞株的轉染等各種常規(guī)分子生物學操作。
操作步驟
1.取1-5 ml過夜培養(yǎng)的菌液，室溫12,000 rpm離心1 min，盡量將上清去除干凈。
2.加入250 ul Buffer P1，用槍頭充分吹打使菌體重懸均勻。
3.加入250 ul Buffer P2，溫和顛倒混勻6-8次，直到溶液變得清亮粘稠。
4.加入350 ul Buffer P3，立即溫和顛倒混勻6-8次，可見白色沉淀物產(chǎn)生，室溫靜置2 min，然后12,000 rpm離心3-5 min。
5.小心將上清液轉移到離心吸附柱Spin Columns PA中，靜置2 min，讓質粒DNA與吸附柱中的硅膠膜充分結合。12,000 rpm離心0.5-1 min，棄收集管中的廢液。
6.向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm離心1 min，棄收集管中廢液。
7.加入500 ul的Buffer PW，室溫12,000 rpm離心0.5-1 min，棄收集管中廢液。
8.重復步驟7一次。
9.室溫12,000 rpm離心2 min，甩干殘留液體。
10.將離心吸附柱Spin Columns PA置于一個新的1.5 ml塑料離心管（自備）中，加入50-100 ul的Buffer EB，室溫放置2 min。12,000 rpm離心1 min，離心管底溶液即質粒DNA。
應用[5]
可用于質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn)研究：
將黏菌素耐藥性質粒(p HNSHP45)轉移到受體菌中,接合頻率高達10-1~10-3,且p HNSHP45質粒能通過接合或轉化轉入肺炎克雷伯菌中,并介導黏菌素耐藥。通過高通量測序獲得該質粒全序列,發(fā)現(xiàn)該質粒全長為62105bp,其G+C為43.0%,具有典型的Inc I2型質粒骨架,并發(fā)現(xiàn)一個1626bp的開放閱讀框與插入序列ISAp I1相連,推測此為該質粒從外源獲得的序列,該基因被命名為mcr-1。
氨基酸序列分析結果顯示MCR-1與磷酸乙醇胺轉移酶有60%左右的相似性,細菌脂質A的ESI-MS分析結果證實了MCR-1功能,即通過修飾細菌細胞膜上的脂質A而介導對黏菌素耐藥。對原菌SHP45和接合子進行傳代實驗,采用S1-PFGE和雜交的方法檢測該質粒的穩(wěn)定性,分別在含黏菌素和不含黏菌素的LB溶液傳代培養(yǎng)14代,發(fā)現(xiàn)質粒p HNSHP45仍能夠穩(wěn)定地存在接合子和原菌SHP45中。
首次發(fā)現(xiàn)了質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1,mcr-1位于接合性Inc I2型質粒上,與插入序列ISAp I1相連。MCR-1屬于磷酸乙醇胺轉移酶,通過修飾細菌細胞膜上脂質A而介導對黏菌素的耐藥。mcr-1基因已在食品動物和動物性食品大腸桿菌中廣泛傳播,且該基因位于接合性質粒上,極易傳播擴散,從分子機制上解釋了目前國內多粘菌素耐藥性迅速升高的原因,為正確評估多粘菌素藥物在動物中的使用提供依據(jù)。
參考文獻
[1]Investigation of a plasmid genome database for colistin-resistance gene mcr-1[J].Satowa Suzuki,Mamoru Ohnishi,Michiko Kawanishi,Masato Akiba,Makoto Kuroda.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)
[2]Colistin resistance gene mcr-1 and pHNSHP45 plasmid in human isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae[J].Nicole Stoesser,Amy J Mathers,Catrin E Moore,Nicholas PJ Day,Derrick W Crook.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)
[3]Carbapenem-resistant and colistin-resistant Escherichia coli co-producing NDM-9 and MCR-1[J].Xu Yao,Yohei Doi,Li Zeng,Luchao Lv,Jian-Hua Liu.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)
[4]Possible genetic events producing colistin resistance gene mcr-1[J].Mauro Petrillo,Alexander Angers-Loustau,Joachim Kreysa.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)
[5]劉藝云.質粒介導的黏菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn)[D].華南農(nóng)業(yè)大學,2016.