背景^[1-3]

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒是一種通過酶聯(lián)免疫技術(shù)（Elisa）原理特異性識(shí)別樣本中人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)的商品化試劑盒。人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒可以通過識(shí)別樣本中人結(jié)腸癌抗原(CCA)的類別及含量為科研及臨床診斷提供依據(jù)。

需要注意的是若用于臨床診斷的Elisa試劑盒需取得上市所在國(guó)的醫(yī)療器械資質(zhì)。同時(shí)人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒的診斷結(jié)論存在一定的局限性，受限于樣本保存不當(dāng)、實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，方法學(xué)靈敏度等原因不能作為臨床判斷的唯一依據(jù)。

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒技術(shù)原理：方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒樣品收集、處理及保存方法:

1.血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè),請(qǐng)按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒操作流程如下:

(1)待測(cè)樣品孔中每孔加入待測(cè)樣品100μl,每種樣品設(shè)3個(gè)平行孔;設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照孔,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔,加入純細(xì)胞裂解液100μl。

(2)酶標(biāo)板置4℃,包被過夜。

(3)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,間歇搖動(dòng)。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。

(4)陰性對(duì)照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的抗體工作液50μl。

(5)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(6)洗板,同(4)。

(7)每孔加1:5000稀釋的抗體工作液100μl。

(8)酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。

(9)洗板,同(4)。

(10)每孔加TMB顯色液100μl,輕輕混勻10s,置37℃暗處反應(yīng)15-20min。

(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。

(12)分別測(cè)450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,測(cè)得的OD值為兩者之差(W1-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

(13)數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的OD值后,計(jì)算S/N值。

應(yīng)用^[4][5]

人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒可以用于NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制以及黃連素對(duì)其影響

研究首先明確了PMNs在NASH早期炎癥啟動(dòng)中的作用及其對(duì)kupffer細(xì)胞的活化作用；其次通過臨床研究發(fā)現(xiàn)PMNs通過其分泌的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)在NASH炎癥中的重要作用,且升高的NE及其內(nèi)源性抑制劑a1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,A1AT的降低可以作為NASH的預(yù)測(cè)因子；然后以NE抑制劑Sivelestat對(duì)NASH炎癥和kupffer細(xì)胞活化進(jìn)行了干預(yù)研究,并在體外直接證明了NE活化kupffer細(xì)胞的TLR4依賴機(jī)制；最后以黃連素(berberine,BBR)在NASH小鼠模型進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)通過降低NE活性并減少kupffer細(xì)胞活化可能是BBR治療NASH的重要機(jī)制。

第一部分NE在NASH kupffer細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)一PMNs介導(dǎo)早期kupffer細(xì)胞活化的研究目的明確中性粒細(xì)胞在NASH早期炎癥啟動(dòng)中的作用及其在kupffer細(xì)胞活化中的作用。

方法：C57BL/6J小鼠分別以正常飲食(standard chow,SC)和蛋氨酸膽堿缺乏(methionine/choline-defecient,MCD)飲食喂養(yǎng)1,2,4,8周。中性粒細(xì)胞特異性抗體(Anti-Ly6G)用來耗竭小鼠外周血中性粒細(xì)胞。人多形核白細(xì)胞彈性蛋白酶(PMNElastase)Elisa試劑盒、CD68,F4/80免疫組化染色以及熒光定量RT-PCR用來檢測(cè)kupffer細(xì)胞活化。結(jié)果在炎癥早期(1-2周),注射Ab-Ly6G小鼠血清ALT水平顯著低于注射IgG的對(duì)照組,肝臟脂肪變與炎癥也明顯減輕,但在炎癥后期(第4、8周)耗竭外周血中性粒細(xì)胞不能明顯減輕NASH小鼠的炎癥。CD68,F4/80免疫組化染色以及熒光定量RT-PCR提示注射Ab-Ly6G能夠延緩kupffer細(xì)胞的活化。

參考文獻(xiàn)

[1]Berberine,a plant alkaloid with lipid-and glucose-lowering properties:From in vitro evidence to clinical studies[J].Angela Pirillo;;Alberico Luigi Catapano.Atherosclerosis.2015

[2]Leptin in nonalcoholic fatty liver disease:A narrative review[J].Stergios A.Polyzos;;Jannis Kountouras;;Christos S.Mantzoros.Metabolism.2015

[3]Increased Neutrophil Elastase and Proteinase 3 and Augmented NETosis Are Closely Associated With[Beta]-Cell Autoimmunity in Patients With Type 1 Diabetes[J].Wang,Yudong;;Xiao,Yang;;Zhong,Ling;;Ye,Dewei;;Zhang,Jialiang;;Tu,Yiting;;Bornstein,Stefan R;;Zhou,Zhiguang;;Lam,Karen SL;;Xu,Aimin.Diabetes.2014

[4]Non-alcoholic fatty liver disease as a cause and a consequence of metabolic syndrome[J].Hannele Yki-J?rvinen.The Lancet Diabetes&Endocrinology.2014

[5]臧淑妃.NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制以及黃連素對(duì)其影響[D].浙江中醫(yī)藥大學(xué),2016.