背景^[1-6]

快速DNA連接模塊是針對(duì)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建專業(yè)設(shè)計(jì)的DNA連接模塊。本產(chǎn)品可在雙鏈平末端DNA片段或雙鏈3′-dA DNA片段的兩端連接Illumina測(cè)序平臺(tái)適用的DNA接頭，具有連接效率高、簡(jiǎn)便、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)。

Fast Pace T4 DNA Ligase：

1.SDS-PAGE純度：>95%。

2.16小時(shí)孵育檢測(cè)：50μL反應(yīng)體系中包含5μl本酶和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解；50μL反應(yīng)體系中包含5μl本酶和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。

3.RNase活性：5μl本酶中加入40 ng FAM-RNA及，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。

4.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應(yīng)體系中加入5μl本酶和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RF II轉(zhuǎn)化比率<10%。

5.核酸外切酶活性：50μL反應(yīng)體系中加入至少5μl本酶和1μg聲振的[3H]DNA（105 cpm/μg），37°C下孵育4小時(shí)，釋放的放射性<0.1%。

6.功能活性（平末端連接）：50μL反應(yīng)體系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.5µL Fast Pace T4 DNA Ligase，18μgHaeIIIφX174，16°C孵育7.5分鐘。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，片段連接率>95%。

7.功能活性（接頭連接）：50μL反應(yīng)體系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.125µL Fast Pace T4 DNA Ligase，8 nmol 12 bp接頭，16°C孵育過(guò)夜。經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，無(wú)明顯未連接接頭。

Fast Pace Ligation Buffer：

1.16小時(shí)孵育檢測(cè)：50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解；50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μg T3 DNA，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。

2.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1μgφX174 RF I DNA，37°C下孵育4小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RF II轉(zhuǎn)化比率<10%。

3.RNase活性：在1×Fast Pace Ligation Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C下孵育16小時(shí)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。

4.磷酸酶活性檢測(cè)：在磷酸酶活性檢測(cè)緩沖液中加入1×Fast Pace Ligation Buffer和2.5 mM對(duì)硝基苯磷酸，37°C下孵育4小時(shí)。經(jīng)光譜測(cè)定法檢測(cè)，405 nm處無(wú)對(duì)硝基苯陰離子特征吸收峰。

應(yīng)用^[7][8]

快速DNA連接模塊可用于快速構(gòu)建DNA文庫(kù)：

隨著基因檢測(cè),免疫試紙條等檢測(cè)工具的廣泛應(yīng)用,酶介導(dǎo)的生物化學(xué)檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視。然而隨著人類生活水平的不斷提高,傳統(tǒng)工具酶已經(jīng)無(wú)法滿足人們的需求。蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化,是在短時(shí)間內(nèi)改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)最主要的手段,通過(guò)不斷的體外進(jìn)化,可以得到對(duì)環(huán)境耐受性較強(qiáng),催化活性較高的進(jìn)化酶。蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于上百種酶的進(jìn)化,在生產(chǎn)生活領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。

蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化主要有兩種手段,一類是以易錯(cuò)PCR為代表的,基于基因突變?cè)順?gòu)建突變體文庫(kù)。這種方法所構(gòu)建的突變體文庫(kù)多樣性較高,但有效性較低,且無(wú)法應(yīng)用于同源性低的DNA片段;另一類是以DNA shuffling為代表的,基于基因重組原理構(gòu)建組合文庫(kù)。該方法不僅可以將同源性較低的DNA片段隨機(jī)組合,而且可以將不同生物體的非同源基因進(jìn)行重組,極大的豐富了DNA重組范圍,有效性較高,但多樣性較低。

針對(duì)現(xiàn)有構(gòu)建組合文庫(kù)方法的缺點(diǎn),以卡那霉素抗性蛋白為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)了一種多模塊組裝構(gòu)建組合文庫(kù)的新方法。該方法從天然存在的蛋白質(zhì)中提取二級(jí)結(jié)構(gòu)元件為模塊,在模塊兩端設(shè)計(jì)可被Hinf I限制性核酸內(nèi)切酶消化的Linker,隨后將消化的DNA模塊以有義方向隨機(jī)連接,并通過(guò)PCR對(duì)重組的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。然后通過(guò)與實(shí)驗(yàn)室自制的SV載體的連接、轉(zhuǎn)化和篩選,構(gòu)建組合文庫(kù)。

通過(guò)篩選,實(shí)驗(yàn)得到了10~5個(gè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)對(duì)500個(gè)克隆的電泳分析,可知插入的重組DNA片段大小不一,具有較好的多樣性;通過(guò)對(duì)20個(gè)克隆的測(cè)序的比對(duì)分析,可知其與野生型蛋白完全不同,且各模塊均為正向連接,說(shuō)明該文庫(kù)多樣性好,有效性高;通過(guò)對(duì)插入片段長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析,不同插入片段模塊組成的分析,不同二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊連接概率分析和模塊長(zhǎng)度與連接概率的關(guān)聯(lián)分析,充分說(shuō)明了所構(gòu)建的組合文庫(kù)各模塊連接的隨機(jī)性。

開發(fā)出了一種全新的能夠?qū)崿F(xiàn)模塊隨機(jī)組裝的文庫(kù)構(gòu)建新方法,通過(guò)簡(jiǎn)單地操作流程,DNA模塊可以完全隨機(jī)組裝成DNA片段。從理論上說(shuō),該方法可以構(gòu)建一個(gè)M^N(M:模塊的組裝數(shù)量,N:模塊數(shù))的龐大組合文庫(kù)。由于本實(shí)驗(yàn)DNA模塊是隨機(jī)組裝的,所以該方法有助于研究蛋白的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系,此外,構(gòu)建的隨機(jī)組合文庫(kù)為計(jì)算機(jī)模擬高通量蛋白質(zhì)篩選以及合成生物學(xué)提供了方法借鑒。

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