背景[1-7]
毒力因子qPCR檢測是通過細菌RNA進行qPCR檢測毒力因子關聯(lián)基因的種類及表達水平已達到檢測細菌毒力水平的目的。毒力因子是構(gòu)成細菌毒力的物質(zhì)，包括細菌毒素，粘附蛋白，細胞表面碳水化合物和保護細菌的蛋白質(zhì)，以及可能有助于細菌致病性的水解酶等。微生物在特定物種的宿主病原菌之所有能感染宿主并且在宿主環(huán)境中繁殖，通常就是依靠一系列的毒力因子之間相互協(xié)調(diào)作用起作用。所以研究病原菌的毒力因子，對于了解病原菌和宿主之間的相互作用有非常重要的作用。
細菌的毒力因子組成：構(gòu)成細菌毒力的物質(zhì)稱為毒力因子(virulent factor),主要有侵襲力和毒素。侵襲力：病原菌在機體內(nèi)定殖,突破機體的防御屏障,內(nèi)化作用,繁殖和擴散,這種能力稱為侵襲力。毒素：細菌毒素按其來源、性質(zhì)和作用等的不同,可分為外毒素和內(nèi)毒素兩大類.在大多數(shù)情況下,外毒素一般簡稱毒素。
毒力表示病原體致病能力的強弱，構(gòu)成細菌毒力的物質(zhì)稱為毒力因子(virulent factor)，主要有侵襲力和毒素。病原菌在機體內(nèi)定殖、突破機體的防御屏障、內(nèi)化作用、繁殖和擴散，這種能力稱為侵襲力。細菌毒素按其來源、性質(zhì)和作用等的不同，可分為外毒素和內(nèi)毒素兩大類。在大多數(shù)情況下，外毒素一般簡稱毒素。病原菌之所有能感染宿主并且在宿主環(huán)境中繁殖，通常就是依靠一系列的毒力因子之間相互協(xié)調(diào)作用起作用。所以研究病原菌的毒力因子，對于了解病原菌和宿主之間的相互作用有非常重要的作用。
應用[8][9]
毒力因子qPCR檢測可用于檢測細菌毒力因子關聯(lián)基因表達研究：
單增李斯特菌是一種重要的食源性致病菌,其導致食物中毒的首要條件是能夠抵抗人體內(nèi)惡劣的胃液環(huán)境。本實驗以單增李斯特菌LM440、ATCC19115、ATCC19111和ATCC15313為受試菌,研究四株不同毒力及來源的受試菌對生長溫度(0℃、4℃、7℃、22℃、37℃、45℃)、NaCl濃度(0、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%)、pH(4.5、5、6、7、8、9.5)的敏感性,在此基礎上分析四株菌對人工胃液(pH=1.5、2.5、3.5)的耐受特性。
結(jié)果表明,四株菌對高、低溫均具有一定的耐受性,不同溫度遲滯時間從小到大依次為45℃<22℃<4℃<7℃;受試菌可生長的鹽濃度范圍是0～6%,而ATCC19115在8%的鹽濃度下仍可緩慢生長;受試菌可生長的pH范圍是5～9.5,此外,當pH=5時,LM440對酸的適應性顯著地強于其它菌株(p<0.05);受試菌在人工胃液pH=3.5時,四株菌的存活率依次為LM440>ATCC19115>ATCC15313>ATCC19111;pH=2.5時,LM440和ATCC19115對人工胃液的耐受能力極顯著地強于ATCC15313和ATCC19111(pp<0.01);pH=1.5時,四株受試菌均在與人工胃液接觸2h后全部死亡,而在1 h時,四株菌存活率的大小依次為ATCC19115>LM440>ATCC19111>ATCC15313。
進一步的將單增李斯菌ATCC19115和LM440分別接種到不同的模擬體系中觀察毒力基因的表達,將ATCC19115接種到魚肉基質(zhì)模擬體系中,LM440接種到胃消化模擬體系中,培養(yǎng)后提取其總RNA,采用RT-qPCR對其四個毒力因子hlyA、inlB、ppfA、sigB的表達進行分析。結(jié)果表明,單增李斯特菌在魚肉基質(zhì)模擬體系中培養(yǎng)后,四個主要毒力因子在三文魚基質(zhì)上的表達量均高于平板對照,其中hlyA在貯藏4℃的三文魚基質(zhì)上表達上調(diào)的最為顯著。
在不同的溫度條件下貯藏24 h,inlB和hlyA的表達量均表現(xiàn)為7℃>4℃>0℃(P<0.01,P<0.01,P<0.01);且4個主要毒力因子在三文魚基質(zhì)上的相對表達量均表現(xiàn)為48h>24h(P<0.01)。在不同基質(zhì)上培養(yǎng)后,進入人工胃液的單增李斯特菌LM 440的存活率與溫度呈明顯的正相關,培養(yǎng)溫度越高,進入人工胃液后的存活率越大。進入人工胃液后的毒力因子hlyA、inlB、prfA、sigB的相對表達量與人工胃液(pH、胃蛋白酶)、培養(yǎng)基質(zhì)、貯藏溫度、貯藏時間均有一定的相關性。
參考文獻
[1]Efficacy of electrolyzed oxidizing water as a pretreatment method for reducing Listeria monocytogenes contamination in cold-smoked Atlantic salmon(Salmo salar)[J].Setareh Ghorban Shiroodi,Mahmoudreza Ovissipour,Carolyn F.Ross,Barbara A.Rasco.Food Control.2016
[2]Expression of Listeria monocytogenes key virulence genes during growth in liquid medium,on rocket and melon at 4,10 and 30°C[J].Agni Hadjilouka,Christina Molfeta,Olga Panagiotopoulou,Spiros Paramithiotis,Marios Mataragas,H.Eleftherios Drosinos.Food Microbiology.2015
[3]Investigating boundaries of survival,growth and expression of genes associated with stress and virulence of Listeria monocytogenes in response to acid and osmotic stress[J].I.P.Makariti,A.Printezi,A.E.Kapetanakou,N.Zeaki,P.N.Skandamis.Food Microbiology.2015
[4]Contributions ofσB and PrfA to Listeria monocytogenes salt stress under food relevant conditions[J].V.B.Ribeiro,S.Mujahid,R.H.Orsi,T.M.Bergholz,M.Wiedmann,K.J.Boor,M.T.Destro.International Journal of Food Microbiology.2014
[5]Listeria monocytogenes Persistence in Food-Associated Environments:Epidemiology,Strain Characteristics,and Implications for Public Health[J].Ferreira,V,Wiedmann,M,Teixeira,P,Stasiewicz,M J.Journal of Food Protection.2014(1)
[6]Strain variability of the behavior of foodborne bacterial pathogens:A review[J].Alexandra Lianou,Konstantinos P.Koutsoumanis.International Journal of Food Microbiology.2013(3)
[7]Listeria monocytogenes prevalence and serotype diversity in various foods[J].Toomas Kramarenko,Mati Roasto,Kadrin Merem?e,Maiu Kuningas,Piret P?ltsama,Terje Elias.Food Control.2013(1)
[8]Salt stress‐induced invasiveness of major L isteria monocytogenes serotypes[J].E.Wa?ecka‐Zacharska,K.Kosek‐Paszkowska,J.Bania,R.Karpí?ková,T.Stefaniak.Lett Appl Microbiol.2013(3)
[9]朱雅慧.應用RT-qPCR技術(shù)研究模擬體系中單增李斯特菌毒力因子表達[D].大連工業(yè)大學,2017.