成人免费xx,国产又黄又湿又刺激不卡网站,成人性视频app菠萝网站,色天天天天

RAB25抗體的應(yīng)用

2024/11/15 14:10:37 作者:云霄

背景[1-3]

RAB25抗體是一種生物素偶聯(lián)的非偶聯(lián)IgG抗體,靶向Rab25,預(yù)測(cè)分子量為23 kDa。RAB25抗體S-可滿足多種應(yīng)用需求,包括包括免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡、ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)。RAB25是參與膜運(yùn)輸?shù)男TP酶RAS超家族的成員。RAB11亞家族的成員,包括RAB25,控制內(nèi)化膜相關(guān)部分向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)。

RAB25抗體.png

RAB25抗體

RAB25抗體使用步驟(Western Blot):

1.樣本制備

1)融解RIPA裂解液(RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液),混勻。

2)貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3)充分裂解后,10000-14000g離心3-5min,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1)取出預(yù)制膠,將預(yù)制膠固定在電泳槽中,內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2)在室溫或不超過(guò)37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3)混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4)100℃或沸水浴加熱3-5min,以充分變性蛋白,之后冷卻至室溫備用。

5)上樣蛋白,并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker,蓋上電泳槽蓋,打開(kāi)電源,電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6)電泳后取出膠板,用刀在側(cè)邊硅膠處,沿著兩片玻璃縫隙切開(kāi)硅膠,即可打開(kāi)玻璃板;取膠時(shí)。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1)將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2)依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片,放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min,如用PVDF膜,需參照說(shuō)明書(shū),先用純甲醇浸泡1-2min,再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3)裝配轉(zhuǎn)移三明治:海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿,每層放好后,用試管趕盡氣泡。

4)將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中,放入三明治,膜靠近陽(yáng)極,膠靠近陰極,加入轉(zhuǎn)移緩沖液,插上電極,100V,1h(電流約為0.3A)。

5)轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,切斷電源,取出膜。

6)將膜浸沒(méi)在5mL麗春紅染色液中,置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長(zhǎng),直待膜上顯示出蛋白條帶。

7)清洗:取出膜,用蒸餾水,PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照,大概沖洗2~3次,每次5min。

8)脫色:將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min;倒去洗脫液,再重復(fù)一次。

9)清洗:再用蒸餾水清洗膜2~3次,每次5min。

10)將膜置于25mL封閉緩沖液中,在室溫下孵育1小時(shí)。

11)用5mL TBST洗滌三次,每次15min。

4.抗體孵育與檢測(cè)

1)將膜和一抗(RAB25抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度)置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過(guò)夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2)用5mL TBST洗滌三次,每次15min以去除殘留的一抗(RAB25抗體)。

3)將膜和二抗(按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度)置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4)用5mL TBST洗滌三次,每次15min。

5)最后一次洗膜的同時(shí),按照ECL超敏試劑盒說(shuō)明書(shū),新鮮配制發(fā)光工作液。

6)用平頭鑷取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中,與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min,準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7)顯影曝光。

應(yīng)用[4][5]

RAB25抗體可以用于Rab25與ERK在骨肉瘤中的表達(dá)及其意義

骨肉瘤(Osteosarcoma)是好發(fā)于青少年的一種惡性腫瘤,該瘤惡性程度甚高,預(yù)后極差,可于短期內(nèi)轉(zhuǎn)移。與其他腫瘤一樣,骨肉瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多階段過(guò)程,尋找其發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因并進(jìn)行阻斷和干預(yù)是目前的研究重點(diǎn)。

Rab25定位于染色體1q22,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的Ras癌基因家族的亞家族Rab中的一員,與Rab11具有同源性,參與細(xì)胞的動(dòng)力過(guò)程。既往研究發(fā)現(xiàn)Rab25在卵巢癌、乳腺癌組織中表達(dá)高于其他組織,認(rèn)為Rab25有可能成為卵巢癌治療的又一新途徑,已有研究顯示Rab25與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后密切相關(guān)。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要成員,參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移全過(guò)程,在多種腫瘤組織中高表達(dá)。

檢測(cè)骨肉瘤及其癌旁組織中Rab25和ERK mRNA及蛋白的表達(dá)水平差異,分析兩者之間關(guān)系及其對(duì)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的影響,為尋找骨肉瘤早期診斷和治療的特異性靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法1.標(biāo)本收集:骨肉瘤及其瘤旁組織均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院和河南大學(xué)淮河醫(yī)院,所有患者均簽訂知情同意書(shū)?;颊吣挲g13-26歲,其中普通型骨肉瘤18例、毛細(xì)血管擴(kuò)張型骨肉瘤9例、小細(xì)胞骨肉瘤3例。癌及癌旁正常組織均經(jīng)病理學(xué)診斷。2.RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)):參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法提取組織RNA,取同等量RNA依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。3.Western blot:參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》方法提取組織蛋白,并進(jìn)行RAB25抗體印跡實(shí)驗(yàn),用DAB顯色、用ECL(化學(xué)發(fā)光法)法曝光顯色。4.半定量分析:蛋白和mRNA均以β-actin為內(nèi)參,應(yīng)用Bioimaging System成像分析系統(tǒng)掃描目的條帶的灰度,檢測(cè)骨肉瘤及其癌旁組織的Rab25和ERKmRNA和蛋白的表達(dá)水平。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所獲資料采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0軟件處理,兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),率的比較采用卡方檢驗(yàn),顯著性水準(zhǔn)取P<0.05。

參考文獻(xiàn)

[1]Activation of mitochondrial ERK protects cancer cells from death through inhibition of the permeability transition.[J].Rasola Andrea;;Sciacovelli Marco;;Chiara Federica;;Pantic Boris;;Brusilow William S;;Bernardi Paolo.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2010

[2]The emerging role of the RAB25 small GTPase in cancer.[J].Agarwal Roshan;;Jurisica Igor;;Mills Gordon B;;Cheng Kwai Wa.Traffic(Copenhagen,Denmark).2009

[3]ARF6-Regulated Shedding of Tumor Cell-Derived Plasma Membrane Microvesicles[J].Vandhana Muralidharan-Chari;;James Clancy;;Carolyn Plou;;Maryse Romao;;Philippe Chavrier;;Graca Raposo;;Crislyn D'Souza-Schorey.Current Biology,2009(22)

[4]Rab25 Associates withα5β1 Integrin to Promote Invasive Migration in 3D Microenvironments[J].Patrick T.Caswell;;Heather J.Spence;;Maddy Parsons;;Dominic P.White;;Katherine Clark;;Kwai Wa Cheng;;Gordon B.Mills;;Martin J.Humphries;;Anthea J.Messent;;Kurt I.Anderson;;Mary W.McCaffrey;;Bradford W.Ozanne;;Jim C.Norman.Developmental Cell,2007(4)

[5]劉志剛.Rab25與ERK在骨肉瘤中的表達(dá)及其意義[D].河南大學(xué),2012.

免責(zé)申明 ChemicalBook平臺(tái)所發(fā)布的新聞資訊只作為知識(shí)提供,僅供各位業(yè)內(nèi)人士參考和交流,不對(duì)其精確性及完整性做出保證。您不應(yīng) 以此取代自己的獨(dú)立判斷,因此任何信息所生之風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)自行承擔(dān),與ChemicalBook無(wú)關(guān)。文章中涉及所有內(nèi)容,包括但不限于文字、圖片等等。如有侵權(quán),請(qǐng)聯(lián)系我們進(jìn)行處理!
閱讀量:3 0

歡迎您瀏覽更多關(guān)于RAB25抗體的相關(guān)新聞資訊信息