背景^[1-3]

OGT抗體是一種可以特異性結(jié)合OGT的人工合成抗體，可以靶向結(jié)合人、小鼠、大鼠和豬樣品中的OGT蛋白。OGT抗體可用于多種科學(xué)應(yīng)用，包括Western Blot、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀和ELISA。

OGT基因編碼一種糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化在O-糖苷鍵中向絲氨酸或蘇氨酸殘基添加單個N-乙酰氨基葡萄糖。由于磷酸化和糖基化都競爭相似的絲氨酸或蘇氨酸殘基，因此這兩個過程可能會競爭位點，或者它們可能會通過空間或靜電效應(yīng)改變附近位點的底物特異性。OGT蛋白質(zhì)包含多個四肽重復(fù)序列，這些重復(fù)序列是識別底物所必需的。O-GlcNAc(O-linked N-acetylglucosamine)糖基化修飾是一種細(xì)胞內(nèi)動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(O-linked N-acetylglucosamine tra nsferase transferase,OGT)以UDP-GlcNAc作為供體底物,將單個N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)與蛋白質(zhì)的絲氮酸或蘇氨酸的羥基形成O-糖苷鍵,而這種修飾的去除是由糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA)完成的。細(xì)胞內(nèi)超過3000種蛋白具有O-GlcNAc修飾,O-GlcNAc修飾參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、配受體相互作用、病毒感染、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、細(xì)胞應(yīng)答以及蛋白質(zhì)翻譯與降解等生物過程。

OGT抗體

OGT抗體使用步驟（Western Blot）：

1.樣本制備

1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-細(xì)胞/組織裂解液緩沖液），混勻。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

2.蛋白電泳

1）取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。

3）混合蛋白樣品和5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）上樣蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時。

3.轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。

8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。

10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。

11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

4.抗體孵育與檢測

1）將膜和一抗（OGT抗體按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4℃下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗(OGT抗體)。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5）最后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液。將膜完全浸入發(fā)光工作液中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。但勿洗去發(fā)光液。

7）顯影曝光。

應(yīng)用^[4][5]

OGT抗體可以用于利用釀酒酵母構(gòu)建OGT活性檢測及新底物篩選體系

在釀酒酵母細(xì)胞中表達OGT的不同亞型,構(gòu)建了OGT各亞型獨立的研究體系;此外,鑒定了表達sOGT的釀酒酵母中O-GlcNAc修飾的內(nèi)源蛋白,并對新發(fā)現(xiàn)的O-GlcNAc修飾蛋白進行了驗證。

研究結(jié)果如下:(1)OGT三個蛋白亞型的主要差別是N端氨基酸序列的不同,我們的研究發(fā)現(xiàn)外源表達不同的OGT亞型對釀酒酵母生長抑制作用具有差異性,這些差異與OGT的N端氨基酸序列的不同組成密切相關(guān);短OGT(short OGT,sOGT)對釀酒酵母的抑制作用依賴于其糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,而核質(zhì)OGT(nuclear/cytoplasma OGT,ncOGT)和線粒體OGT(mitochondrial OGT,mOGT)的抑制作用不依賴于其催化活性;表達sOGT的釀酒酵母細(xì)胞可用于進行OGT的底物分析。(2)mOGT具有使其定位于線粒體內(nèi)膜的N端基質(zhì)導(dǎo)向序列(matrix targeting sequence,MTS)。在釀酒酵母中表達人源mOGT及其N端截短的突變體后,生長點板顯示mOGT對釀酒酵母生長抑制作用依賴于其N端MTS序列;MTS序列的表達能引起酵母線粒體的融合,因此表達MTS序列的釀酒酵母有望成為哺乳動物細(xì)胞中mOGT過表達導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究模型。(3)利用sWGA agarose對表達sOGT的酵母細(xì)胞中O-GlcNAc修飾的內(nèi)源蛋白進行富集,并通過nanoLC-MS/MS鑒定到了468個O-GlcNAc修飾的酵母蛋白質(zhì),其中有13個被修飾的蛋白具有與其氨基酸序列一致性高于30%的人源蛋白,而且該人源蛋白的O-GlcNAc修飾狀態(tài)在哺乳動物中尚未被報道。從中挑選了泛素結(jié)合酶2(ubiquitin-conjugating enzyme E2-16 kDa,Ubc5)、真核肽段釋放因子的GTP結(jié)合亞基(eukaryotic peptide chain release factor of GTP-binding subunit,Sup35)、支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶2(cytosolic branched-chain-amino-acid aminotransferase,Bat2)及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,Esa1)等蛋白與sOGT在釀酒酵母中共表達,通過OGT抗體蛋白質(zhì)的免疫沉淀及抗O-GlcNAc的蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)Ubc5、Sup35、Bat2及Esa1均被O-GlcNAc修飾,從而驗證了我們的O-GlcNAc修飾蛋白的富集及質(zhì)譜分析方法是可信的。

參考文獻

[1]RNA Aptamers Rescue Mitochondrial Dysfunction in a Yeast Model of Huntington’s Disease[J].Kinjal A.Patel;;Rajeev K.Chaudhary;;Ipsita Roy.Molecular Therapy-Nucleic Acids.2018

[2]A review of the role of chemical modification methods in contemporary mass spectrometry-based proteomics research[J].Alexander Leitner.Analytica Chimica Acta.2018

[3]A Conserved Splicing Silencer Dynamically Regulates O-GlcNAc Transferase Intron Retention and O-GlcNAc Homeostasis[J].Sung-Kyun Park;;Xiaorong Zhou;;Kathryn E.Pendleton;;Olga V.Hunter;;Jennifer J.Kohler;;Kathryn A.O’Donnell;;Nicholas K.Conrad.Cell Reports,2017(5)

[4]Yeast cells as an assay system for in vivo O-GlcNAc modification[J].Hideki Nakanishi;;Feng Li;;Baoxian Han;;Seisuke Arai;;Xiao-Dong Gao.BBA-General Subjects.2017

[5]李鳳.利用釀酒酵母構(gòu)建OGT活性檢測及新底物篩選體系[D].江南大學(xué),2020.