背景及概述[1-2]
基因組編輯(簡稱為基因編輯)技術(shù)是利用人工核酸酶對基因組進行靶向修飾的遺傳工程技術(shù)，是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)雖然提高了基因敲除及定點修飾(包括定點突變及基因插入等)的效率，但是基于同源重組機制的基因定點突變效率仍然偏低。為了提高定點突變的效率，一項結(jié)合CRISPR/Cas9和胞嘧啶脫氨酶的單堿基編輯系統(tǒng)被相繼報道。利用該系統(tǒng)可以在不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂的情況下，利用sgRNA將Cas9-胞嘧啶脫氨酶-尿嘧啶糖基化酶抑制子三者構(gòu)成的融合蛋白靶向與gRNA(sgRNA中與目標(biāo)DNA互補配對的序列)互補配對的靶位點，并將該靶位點的胞嘧啶(C)的氨基去除，從而使得C變成尿嘧啶(U)，隨著DNA的復(fù)制，U又會被胸腺嘧啶(T)替代，最終實現(xiàn)單堿基C→T的精確、高效突變。單堿基編輯技術(shù)為基因編輯技術(shù)的研究和應(yīng)用增添了一種重要的工具。
原理[2]
單堿基編輯法可以精確地、不可逆地實現(xiàn)從一種堿基對到另一種堿基對的轉(zhuǎn)變，而無需DSB或HDR。最初的堿基編輯器是用一個單鏈DNA特異性胞苷脫氨酶結(jié)合一個失活的Cas9(dCas9)，在靶區(qū)域使胞嘧啶(C)•鳥嘌呤(G)堿基對轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)•腺嘌呤(A)。脫氨酶-Cas9復(fù)合體利用Cas9：guideRNA：DNA三元復(fù)合體的R環(huán)中的一小段單鏈DNA，在靶序列的很小的窗口（約3至5個核苷酸）內(nèi)催化胞嘧啶脫氨轉(zhuǎn)化為尿苷。通過融合褐家鼠APOBEC1胞苷脫氨酶、化膿性鏈球菌Cas9n(D10A)和枯草芽孢桿菌噬菌體PBS2UGI，生成了堿基編輯器-BE3。
BE3可形成C•G到T•A的永久性轉(zhuǎn)變，有比HDR更高的編輯效率（15-75%vs<5%），插入突變率（低于5%）比Cas9基因編輯方法更低。除此之外，多項研究表明BE3比Cas9擁有更低的脫靶率。為了進一步降低非特異性的突變，將BE3和高保真的SpCas9(HF-Cas9)相結(jié)合，降低了BE3和非目標(biāo)位點的親和力，從而創(chuàng)造出了擁有更低脫靶率的HF-BE3。然而，它同時也降低了目標(biāo)位點的編輯率。為了實現(xiàn)單堿基編輯的可調(diào)控性，研究人員設(shè)計了一種可以調(diào)控的堿基編輯器，將催化自我切割的RNA酶加入guideRNA，只有當(dāng)配體和它結(jié)合的時候，guideRNA才發(fā)揮作用。雖然該體系在沒有配體的情況下，仍表現(xiàn)出一定的活性，但是其效率比標(biāo)準(zhǔn)的guideRNA低很多，這就使得堿基編輯受控于配體。其它活性誘導(dǎo)的方法，如借助光遺傳學(xué)，將光敏感小分子結(jié)合到堿基編輯器上，使得基因編輯可以得到調(diào)控。除了BE3，還有多種方法來解決DSBs的固有局限。Target-AID是一種類似BE3的堿基編輯器，它使用了可選擇的結(jié)構(gòu)域和脫氨酶，從而使C•G到T•A的轉(zhuǎn)變過程中有一個可變的脫氨基作用區(qū)域。另外，通過改變PAM序列獲得了堿基編輯能力更強的BE3變異體，將可編輯的潛在基因庫增加了2.5倍，擁有更高的靈敏度和更低的脫靶率。
應(yīng)用[1]
1.單堿基編輯系統(tǒng)在人類疾病治療方面的應(yīng)用
來自上海交通大學(xué)的常興組率先開發(fā)了dCas9-AIDx堿基編輯系統(tǒng)，并將其應(yīng)用到腫瘤研究中。在腫瘤疾病治療過程中，基因上特定位點的堿基突變會使部分腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性，如在慢性髓系白血病(chronicmyloidleukemia，CML)的治療中，常使用伊馬替尼藥物來抑制癌細胞中BCRABL激酶的活性，從而抑制白細胞的過度增殖。
但是，在治療過程中，癌細胞會在特定基因序列點突變(如常見的T315I突變)后產(chǎn)生耐藥性，這是目前腫瘤治療的一大障礙。針對這個問題，常興組在CML患者來源的K562細胞系中表達了dCas9-hAIDx的融合蛋白，由于沒有使用UGI，因此AIDx修飾的胞嘧啶C及互補的鳥嘌呤A可以隨機地向其它三種堿基轉(zhuǎn)變。他們使用sgRNA文庫將dCas9-AIDx靶向到ABL基因的第6個外顯子，誘導(dǎo)點突變的發(fā)生。通過用伊馬替尼藥物篩選，將伊馬替尼耐藥的細胞與篩選前細胞的ABL的第6個外顯子進行深度測序分析，發(fā)現(xiàn)了10個與伊馬替尼耐藥相關(guān)的基因突變位點，包括了在臨床中已被證實的T315I突變。該研究證明，可以利用此系統(tǒng)篩選腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的突變，探究腫瘤疾病的耐藥機制，開創(chuàng)了篩選腫瘤耐藥突變的新方法，結(jié)合第二代測序技術(shù)在臨床中的應(yīng)用，將有助于癌癥病人耐藥的早期發(fā)現(xiàn)，提高癌癥病人的生存率。
2. 單堿基編輯系統(tǒng)在動物模型方面的應(yīng)用
目前，大多數(shù)關(guān)于單堿基編輯系統(tǒng)的研究報告主要基于細胞實驗，而其在動物模型開發(fā)中的應(yīng)用將有利于研究人員深入研究疾病發(fā)生和發(fā)展的機理。韓國首爾大學(xué)Jin-SooKim組率先發(fā)表了將rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI(BE3)系統(tǒng)運用于小鼠疾病模型制備的研究成果。針對小鼠的抗肌萎縮蛋白基因Dmd以及酪氨酸酶基因Tyr，分別設(shè)計了特異識別的sgRNA，顯微注射sgRNA和rAPOBEC1-XTEN -Cas9n-UGI融合蛋白的mRNA或者電轉(zhuǎn)染sgRNA和rAPOBEC1-Cas9n-UGI蛋白的復(fù)合物到小鼠受精卵。
在所獲得的9只Dmd的F0代小鼠中，有5只小鼠產(chǎn)生了靶位點的堿基突變，包括一只純合子突變小鼠(CAG＞TAG)。進一步通過免疫染色發(fā)現(xiàn)，在這只純合子Dmd突變小鼠體內(nèi)幾乎檢測不到該蛋白的表達。而通過電轉(zhuǎn)染gRNA和rAPOBEC-XTEN-Cas9n-UGI融合蛋白的復(fù)合物，產(chǎn)生了7只TyrF0后代小鼠中均檢測到靶基因突變，包括3只純合子Tyr突變小鼠。
與Jin-SooKim的發(fā)現(xiàn)類似，黃軍就組也發(fā)現(xiàn)了堿基編輯系統(tǒng)會在胚胎中產(chǎn)生堿基的缺失，并首次報道了在小鼠胚胎中由堿基編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的靶位點處的堿基插入以及臨近位點的脫氨基。由于所用的dCas9-HF2不具有核酸酶活性，他們認為，堿基的插入和缺失是由于胞嘧啶脫氨基后產(chǎn)生的U被堿基切除修復(fù)機制識別，并被切除從而產(chǎn)生無堿基位點，無堿基位點再進一步轉(zhuǎn)化成DNA雙鏈損傷，從而導(dǎo)致堿基插入和缺失的產(chǎn)生。以上兩項研究結(jié)果充分證明了單堿基編輯系統(tǒng)能高效地用于制備疾病動物模型，但仍需進一步優(yōu)化來提高特異性及降低堿基插入和缺失的產(chǎn)生。
3. 單堿基編輯系統(tǒng)在植物方面的應(yīng)用
轉(zhuǎn)基因技術(shù)在改良作物性狀方面已經(jīng)做了大量的工作，但由于外源基因的導(dǎo)入和公眾科普的缺乏，使得轉(zhuǎn)基因作物的推廣和應(yīng)用存在較大難度。作物在漫長的人工選育過程中，人類通過人工選擇的方式定向選育具有優(yōu)良性狀的基因突變株，但該過程耗時耗力且不可控。利用同源重組技術(shù)，可以獲得定點修飾的優(yōu)良植物株，但由于同源重組的效率太低，因此可行性不高。單堿基編輯技術(shù)在人細胞中高效編輯單個堿基的結(jié)果提示，可以通過該系統(tǒng)在農(nóng)作物中的進行定點可控的基因編輯，進而快速、高效地獲得優(yōu)良性狀的植株。
研究還發(fā)現(xiàn)在作物中胞嘧啶核苷脫氨酶的作用活性窗口為7個核苷酸序列，從距離PAM最遠端數(shù)起的第3～9位核苷酸，這相對于在動物細胞中的編輯窗口更廣。嘗試采用土壤桿菌為載體，攜帶Cas9n-XTEN-rAPOBEC1-UGI融合蛋白和sgRNA，編輯水稻內(nèi)一種衰老控制基因OsCDC48。研究結(jié)果顯示，單堿基編輯效率在5.0%～32.5%，靶位點處沒有發(fā)現(xiàn)核苷酸序列的隨機插入或缺失，而且預(yù)測可能的脫靶位點處也沒有發(fā)現(xiàn)突變。同一時間，中科院上海生命科學(xué)研究院的朱健康團隊和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所的夏蘭琴團隊也分別報道了運用單堿基編輯系統(tǒng)對水稻基因進行單堿編輯。這三個獨立的研究表明，單堿基編輯系統(tǒng)可以在農(nóng)作物中取得高效的編輯效率，為改良作物品種帶來新希望。最近，美國農(nóng)業(yè)部官方宣布基因編輯的部分玉米、土豆和黃豆新種是非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，不受轉(zhuǎn)基因法規(guī)監(jiān)管。因此，我國需要加大對基因編輯技術(shù)育種的支持力度，這將會使我國在育種領(lǐng)域獲得國際領(lǐng)先的地位。
主要參考資料
[1] 單堿基編輯系統(tǒng)的研究進展
[2] 單堿基編輯工具及在基因治療中的應(yīng)用及前景