背景[1-3]
BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系建系于1989年，該細(xì)胞系來源于人膀胱乳頭狀移行上皮癌，通常采用5×108細(xì)胞0.2mL接種裸鼠皮下，呈進(jìn)行性腫瘤生長，腫瘤結(jié)節(jié)病檢與原標(biāo)本癌組織相似。22代細(xì)胞群體倍增時(shí)間為34小時(shí)。細(xì)胞能在軟瓊脂上生長，克隆形成率23%。BIU-87細(xì)胞系對ConA，WGA，PSL均有凝集反應(yīng)。
BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系
BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
BIU-87人膀胱癌貼壁細(xì)胞系可以用于siRNA DAD1聯(lián)合人參皂苷Rh2對膀胱癌BIU-87細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)驗(yàn)研究
研究siRNA沉默DAD1基因?qū)θ藚⒃碥誖h2體外抗膀胱癌效果的影響,探討中藥提取物人參皂苷Rh2聯(lián)合RNAi技術(shù)抗腫瘤的可能性和實(shí)驗(yàn)效果,為臨床的綜合抗腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
方法:本研究主要對象是人膀胱癌細(xì)胞BIU-87:首先采用不同濃度人參皂苷Rh2作用于膀胱癌細(xì)胞株BIU-87,MTT法檢測其增殖能力,篩選出最適宜的人參皂苷Rh2作用條件;然后人參皂苷Rh2聯(lián)合轉(zhuǎn)染siRNA-DAD1干預(yù)膀胱癌細(xì)胞株BIU-87;MTT法檢測聯(lián)合作用后的BIU-87細(xì)胞增殖能力;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測DAD1 mRNA的表達(dá)水平;免疫印跡法檢測DAD1蛋白的表達(dá)水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測膀胱癌細(xì)胞BIU-87的凋亡水平;Transwell檢測各組膀胱癌細(xì)胞株BIU-87的侵襲能力變化。
結(jié)果:人參皂苷Rh2不同濃度和干預(yù)時(shí)間可以對膀胱癌細(xì)胞BIU-87的增殖能力有一定程度的抑制作用(P<0.05);人參皂苷Rh2 40umol/L聯(lián)合siRNA-DAD1作用膀胱癌細(xì)胞BIU-87后,MTT法檢測膀胱癌細(xì)胞BIU-87的增殖水平下降(P<0.05);熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞BIU-87中的DAD1 mRNA表達(dá)水平降低了(P<0.05);免疫印跡檢測結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞BIU-87中的DAD1蛋白表達(dá)水平降低了(P<0.05);流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞BIU-87的凋亡水平升高了(P<0.05);Transwell檢測結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞BIU-87的侵襲能力顯著下降(P<0.05)。
結(jié)論:1.一定濃度的人參皂苷Rh2可以抑制膀胱癌細(xì)胞BIU-87增殖。
2.人參皂苷Rh2聯(lián)合siRNA-DAD1作用于膀胱癌細(xì)胞BIU-87可以顯著抑制DAD1的表達(dá),并且促使其發(fā)生凋亡,抑制其侵襲能力。
參考文獻(xiàn)
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