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DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒是一種借助辣根過氧化物酶(HRP)，用于免疫組化顯色、原位雜交顯色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜顯色的試劑盒。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒

DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根過氧化物酶的常用底物。在辣根過氧化物酶的催化下，DAB會產(chǎn)生棕色沉淀。該棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB顯色后，還可以使用溶于乙醇的染料進(jìn)行后續(xù)染色。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒可以用于細(xì)胞或組織在免疫組化或原位雜交時結(jié)合的辣根過氧化物酶顯色，也可以用于Western等結(jié)合有辣根過氧化物酶的膜的顯色檢測。同時也可以用于細(xì)胞或組織內(nèi)源性的辣根過氧化物酶顯色。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒操作步驟：

1、常規(guī)組織切片、細(xì)胞樣品、膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體或其它形式的探針孵育后，用適當(dāng)洗滌液洗滌3～5次，每次3～5min。對于檢測內(nèi)源性辣根過氧化物酶的組織或細(xì)胞樣品，在適當(dāng)固定后，也可用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5min。

2、按(A):試劑(B):試劑(C)=5000:5000:3的比例混合,即為DAB染色工作液，即配即用。

3、洗滌過組織后，去除洗滌液，加入適量DAB染色工作液，確保覆蓋樣品。

4、室溫避光孵育30min或更長時間，直至顯色至預(yù)期深淺。

5、去除DAB染色工作液，用蒸餾水清洗1～2次即可終止顯色反應(yīng)。

6、對組織切片或細(xì)胞樣品，反應(yīng)終止后，如有必要可用中性紅染色液染色，便于觀察。對于膜染色，反終止后可室溫晾干避光保存。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒常見問題及可能原因：

1、背景顯色太深

①在免疫組化時如果背景顯色太深，考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，例如選購適當(dāng)?shù)姆忾]液或使用和一抗相同來源的血清(10%)進(jìn)行封閉。也應(yīng)請注意選購經(jīng)過適當(dāng)吸附的二抗，以減小二抗的非特異性吸附。

②在進(jìn)行含內(nèi)源性過氧化氫酶的免疫組化時，如果背景顯色太深，需注意滅活內(nèi)源性過氧化氫酶?？梢栽?體積甲醇中加入1體積3%過氧化氫，混勻后用于內(nèi)源性過氧化氫酶的滅活。

③可以考慮縮短顯色時間，或降低二抗?jié)舛取?/p>

④選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或延長洗滌時間。

2、沒有顯色或顯色太弱

①當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。檢測二抗效果，滴一滴稀釋二抗在膜上，檢測二抗是否可以被正常顯色。

②考慮使用更加靈敏的放大檢測體系，例如使用生物素檢測體系。

③適當(dāng)延長顯色時間，另外確定抗原修復(fù)是否對于使用的一抗是必需的。

應(yīng)用^[4][5]

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒可以用于辣根過氧化物酶標(biāo)記二氧化硅納米顆粒的制備及其在免疫分析中的應(yīng)用

辣根過氧化物酶標(biāo)記二氧化硅納米顆粒的及其抗體復(fù)合物制備過程,并以乙肝表面抗原為檢測模型進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

通過油包水(W/O)型微乳體系,制備了直徑為50±5 nm的二氧化硅納米顆粒,以此為載體,制備了抗體-酶-硅納米顆粒復(fù)合物。通過氨基硅烷修飾在硅納米顆粒的表面引入氨基,然后利用高碘酸鈉氧化法將HRP標(biāo)記在顆粒表面,最后通過氧化葡聚糖的橋接作用將乙肝表面的抗體分子標(biāo)記到酶標(biāo)記的納米顆粒表面?？疾炝巳N不同氨基硅烷對于HRP標(biāo)記效率的影響,利用免疫分析的效果來考察HRP和抗體分子不同的用量對于酶標(biāo)記二氧化硅納米顆粒-抗體復(fù)合物標(biāo)記效果的影響。

最后在的條件下檢測乙肝表面抗原,其靈敏度達(dá)到0.06 ng/mL,線性范圍0.15-12.5 ng/mL,對260份血清樣品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA完全一致,對30份陽性血清樣品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA相關(guān)性良好,相關(guān)系數(shù)r為0.992。

辣根過氧化物酶標(biāo)記二氧化硅納米顆粒在氯霉素檢測中的應(yīng)用,在這一章中通過檢測小分子藥物氯霉素的實(shí)驗(yàn)來考察辣根過氧化物酶標(biāo)記二氧化硅納米顆粒在競爭型ELISA中應(yīng)用的可行性。

實(shí)驗(yàn)中,采用了三種不同的免疫分析策略以及兩種氨基硅烷制備的酶標(biāo)記物對氯霉素進(jìn)行檢測。該方法對氯霉素檢測的靈敏度最低可以達(dá)到0.012 ng/mL,而且線性良好。

以最終選定的策略和標(biāo)記物進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn),回收率在85.01%-101.23%之間,CV在6.89%-25.66%,而且與傳統(tǒng)的ELISA相關(guān)性良好。

綜上所述,提出了一種基于二氧化硅納米顆粒的新型酶標(biāo)記物及其制備方法。實(shí)驗(yàn)證明,與傳統(tǒng)的直接將酶分子標(biāo)記到抗體(或抗原)分子的方法相比,該方法具有操作靈活,過程可控,重復(fù)性高,純化容易,且具有一定的信號放大能力的優(yōu)點(diǎn)。因此,該標(biāo)記方法具有極大的應(yīng)用價值。

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