背景^[1-3]

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒是一種借助辣根過氧化物酶(HRP)，用于免疫組化顯色、原位雜交顯色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜顯色的試劑盒。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒

DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根過氧化物酶的常用底物。在辣根過氧化物酶的催化下，DAB會產生棕色沉淀。該棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB顯色后，還可以使用溶于乙醇的染料進行后續(xù)染色。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒可以用于細胞或組織在免疫組化或原位雜交時結合的辣根過氧化物酶顯色，也可以用于Western等結合有辣根過氧化物酶的膜的顯色檢測。同時也可以用于細胞或組織內源性的辣根過氧化物酶顯色。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒操作步驟：

1、常規(guī)組織切片、細胞樣品、膜與辣根過氧化物酶標記的抗體或其它形式的探針孵育后，用適當洗滌液洗滌3～5次，每次3～5min。對于檢測內源性辣根過氧化物酶的組織或細胞樣品，在適當固定后，也可用洗滌液洗滌3～5次，每次3～5min。

2、按(A):試劑(B):試劑(C)=5000:5000:3的比例混合,即為DAB染色工作液，即配即用。

3、洗滌過組織后，去除洗滌液，加入適量DAB染色工作液，確保覆蓋樣品。

4、室溫避光孵育30min或更長時間，直至顯色至預期深淺。

5、去除DAB染色工作液，用蒸餾水清洗1～2次即可終止顯色反應。

6、對組織切片或細胞樣品，反應終止后，如有必要可用中性紅染色液染色，便于觀察。對于膜染色，反終止后可室溫晾干避光保存。

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒常見問題及可能原因：

1、背景顯色太深

①在免疫組化時如果背景顯色太深，考慮使用適當?shù)姆忾]液進行封閉，例如選購適當?shù)姆忾]液或使用和一抗相同來源的血清(10%)進行封閉。也應請注意選購經過適當吸附的二抗，以減小二抗的非特異性吸附。

②在進行含內源性過氧化氫酶的免疫組化時，如果背景顯色太深，需注意滅活內源性過氧化氫酶。可以在4體積甲醇中加入1體積3%過氧化氫，混勻后用于內源性過氧化氫酶的滅活。

③可以考慮縮短顯色時間，或降低二抗?jié)舛取?/p>

④選擇適當強度的洗滌液，或延長洗滌時間。

2、沒有顯色或顯色太弱

①當提高一抗或二抗的濃度。檢測二抗效果，滴一滴稀釋二抗在膜上，檢測二抗是否可以被正常顯色。

②考慮使用更加靈敏的放大檢測體系，例如使用生物素檢測體系。

③適當延長顯色時間，另外確定抗原修復是否對于使用的一抗是必需的。

應用^[4][5]

DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒可以用于辣根過氧化物酶標記二氧化硅納米顆粒的制備及其在免疫分析中的應用

辣根過氧化物酶標記二氧化硅納米顆粒的及其抗體復合物制備過程,并以乙肝表面抗原為檢測模型進行實際應用。

通過油包水(W/O)型微乳體系,制備了直徑為50±5 nm的二氧化硅納米顆粒,以此為載體,制備了抗體-酶-硅納米顆粒復合物。通過氨基硅烷修飾在硅納米顆粒的表面引入氨基,然后利用高碘酸鈉氧化法將HRP標記在顆粒表面,最后通過氧化葡聚糖的橋接作用將乙肝表面的抗體分子標記到酶標記的納米顆粒表面?？疾炝巳N不同氨基硅烷對于HRP標記效率的影響,利用免疫分析的效果來考察HRP和抗體分子不同的用量對于酶標記二氧化硅納米顆粒-抗體復合物標記效果的影響。

最后在的條件下檢測乙肝表面抗原,其靈敏度達到0.06 ng/mL,線性范圍0.15-12.5 ng/mL,對260份血清樣品的檢測結果與傳統(tǒng)的ELISA完全一致,對30份陽性血清樣品的檢測結果與傳統(tǒng)ELISA相關性良好,相關系數(shù)r為0.992。

辣根過氧化物酶標記二氧化硅納米顆粒在氯霉素檢測中的應用,在這一章中通過檢測小分子藥物氯霉素的實驗來考察辣根過氧化物酶標記二氧化硅納米顆粒在競爭型ELISA中應用的可行性。

實驗中,采用了三種不同的免疫分析策略以及兩種氨基硅烷制備的酶標記物對氯霉素進行檢測。該方法對氯霉素檢測的靈敏度最低可以達到0.012 ng/mL,而且線性良好。

以最終選定的策略和標記物進行回收率實驗,回收率在85.01%-101.23%之間,CV在6.89%-25.66%,而且與傳統(tǒng)的ELISA相關性良好。

綜上所述,提出了一種基于二氧化硅納米顆粒的新型酶標記物及其制備方法。實驗證明,與傳統(tǒng)的直接將酶分子標記到抗體(或抗原)分子的方法相比,該方法具有操作靈活,過程可控,重復性高,純化容易,且具有一定的信號放大能力的優(yōu)點。因此,該標記方法具有極大的應用價值。

參考文獻

[1]Performance characteristics of an analytical procedure for determining chloramphenicol residues in muscle tissue by gas chromatography–electron capture detection[J].VesnaCerkvenik‐Flajs.Biomed.Chromatogr.,2006(10)

[2]Determination of chloramphenicol residues in meat,seafood,egg,honey,milk,plasma and urine with liquid chromatography–tandem mass spectrometry,and the validation of the method based on 2002/657/EC[J]..Journal of Chromatography A,2006(2)

[3]A monoclonal antibody-based time-resolved fluoroimmunoassay for chloramphenicol in shrimp and chicken muscle[J].Jianzhong Shen;;Zhen Zhang;;Yan Yao;;Weimin Shi;;Yibing Liu;;Suxia Zhang.Analytica Chimica Acta,2006(2)

[4]Point-of-care-testing and Clinical Governance[J].Joan Pearson.Clinical Chemical Laboratory Medicine,2006(6)

[5]柯榮秦.辣根過氧化物酶標記二氧化硅納米顆粒的制備及其在免疫分析中的應用[D].廈門大學,2008.