背景及概述^[1]

L－乳酸鈣屬于天然活性離子鈣，是經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為食品使用的一種鈣制劑，化學(xué)分子式為C6H10CaO6·5H2O，因具有鈣含量高、溶解度較大、吸收率高、安全性高、價(jià)格合理等優(yōu)點(diǎn)而備受重視。L－乳酸鈣性狀見(jiàn)下圖。

圖1  L－乳酸鈣性狀圖

制備

生物發(fā)酵生產(chǎn)法制備L－乳酸鈣

國(guó)內(nèi)外L－乳酸鈣的生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵生產(chǎn)法，后者更為常見(jiàn)和重要。目前研究較為成熟的L－乳酸鈣生產(chǎn)菌種并不多，主要有乳桿菌（Lactobacillus spp．）和米根霉（Rhizopus oryzae），其中米根霉發(fā)酵能生產(chǎn)出高純度的L－乳酸鈣，是研究較多的一種菌株。米根霉菌體生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出很復(fù)雜的生長(zhǎng)形態(tài)，主要有分散菌絲體、菌球、絮狀體和較大塊的聚結(jié)物等。培養(yǎng)過(guò)程中菌絲體很容易結(jié)成大團(tuán)，纏繞攪拌槳，從而影響發(fā)酵液的流變學(xué)特性和反應(yīng)器的質(zhì)量傳遞效能，對(duì)乳酸的生成和糖的轉(zhuǎn)化率有很大的影響。此外，Ca2＋對(duì)菌體形態(tài)也會(huì)有很大影響，一般在乳酸發(fā)酵過(guò)程中會(huì)選擇以CaCO3作為中和劑。本研究主要考察米根霉發(fā)酵條件對(duì)其產(chǎn)L－乳酸鈣的影響，優(yōu)化發(fā)酵條件，以期對(duì)L－乳酸鈣的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 米根霉種子液的制備①平板培養(yǎng)。

PDA 平板接種100 μL 孢子懸液，涂布，34 ℃培養(yǎng)3～5 d。菌絲形態(tài)的觀察采用插片法， 將無(wú)菌蓋玻片以45°斜插入接種后的培養(yǎng)基中。②種子培養(yǎng)。500 mL 的搖瓶中裝液量100 mL，121 ℃滅菌20 min，取適量孢子接種于培養(yǎng)基上，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h， 考察不同接種量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)種子培養(yǎng)的影響。

2 米根霉發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)L－乳酸鈣①搖瓶發(fā)酵。

1000 mL 的搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量100 mL，121 ℃滅菌20 min，接入制備好的種子液，在一定發(fā)酵溫度下180 r ／min 振蕩培養(yǎng)72 h， 發(fā)酵過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)加適量CaCO3，控制發(fā)酵液的pH。②發(fā)酵罐發(fā)酵。5 000 mL 的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量2500mL，121 ℃滅菌20 min， 接入制備好的種子液，以100～150 r ／min 的轉(zhuǎn)速攪拌，在一定發(fā)酵溫度下培養(yǎng)72 h，發(fā)酵過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)加適量CaCO3懸濁液，控制發(fā)酵液的pH?？疾斐跏及l(fā)酵的葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響，初始葡萄糖濃度梯度為60、80、100、120、140 g ／ L， 發(fā)酵溫度梯度為28、30、32、34 和36 ℃。

3 L－乳酸鈣晶體的制備將發(fā)酵液

用布氏漏斗加兩層化學(xué)分析用濾紙進(jìn)行抽濾，收集濾液。于70 ℃下加10 g ／ L 活性炭脫色30 min， 趁熱抽濾，收集濾液，放置在70 ℃烘箱濃縮到合適的體積后使其在4 ℃下低溫結(jié)晶，抽濾得到產(chǎn)品，濾液可重復(fù)上述步驟進(jìn)行產(chǎn)品結(jié)晶，晶體放置于70 ℃烘箱干燥。

4 200 L 發(fā)酵罐中試研究培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。

利用膜過(guò)濾技術(shù)處理發(fā)酵液。首先用100 目篩網(wǎng)過(guò)濾掉菌絲球（ 濾液1）， 然后在70 ℃下加10 g ／ L 活性炭脫色1 h，再用超濾膜過(guò)濾（濾液2）除掉其中的大分子雜質(zhì)，取濾液用反滲透膜過(guò)濾（濾液3），將濾液濃縮到一定的體積（濃縮液1）后放置在4 ℃下進(jìn)行低溫結(jié)晶，直到有大量晶體析出并且可見(jiàn)液體很少，抽濾得到產(chǎn)品，剩下的濾液進(jìn)行第二次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（濃縮液2），4 ℃低溫結(jié)晶，晶體放置于70 ℃烘箱干燥。

5 檢測(cè)方法①殘?zhí)堑臋z測(cè)。

采用DNS 法和血糖儀法檢測(cè)殘?zhí)呛?，?jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)化率。②L－乳酸鈣含量的檢測(cè)。采用EDTA 定鈣法和HPLC法檢測(cè)成品中L－乳酸鈣含量。本試驗(yàn)選擇以近海生物牡蠣的殼為原料詳細(xì)探討L- 乳酸鈣的制備工藝, 為牡蠣殼的綜合利用提供新的途徑。

化學(xué)合成法制備L－乳酸鈣

1 工藝流程

牡蠣殼→清洗→烘干粉碎→過(guò)篩→酸溶→用1 mol/L NaOH 將濾液調(diào)至pH6~7 后, 加入1 mol/L 的Na2CO3 溶液[4], 得到白色沉淀, 離心分離沉淀→煅燒得到CaO→加水調(diào)制石灰乳→用L- 乳酸中和, 得結(jié)晶物(五水合L- 乳酸鈣)→用無(wú)水乙醇洗滌→抽濾→干燥, 得到五水合L- 乳酸鈣顆粒。

2 牡蠣殼的酸溶條件

將牡蠣殼用水清洗, 除去雜質(zhì), 并置于120 ℃的烘箱中干燥, 粉碎過(guò)篩, 得20 目的牡蠣殼粉, 加入稍過(guò)量的一定濃度的鹽酸溶解, 過(guò)濾除去雜質(zhì), 得到含有鈣離子的濾液。

3 碳酸鈣的煅燒

調(diào)節(jié)含有鈣離子的濾液至pH7~8, 加入適量的1 mol/L 的Na2CO3 溶液使鈣離子充分沉淀, 離心分離沉淀, 抽濾洗滌得到白色的碳酸鈣,烘干得白色的CaCO3 粉末。放置在馬弗爐中煅燒,得到白色的CaO 粉末。

4 五水合L- 乳酸鈣制備

將煅燒分解后的CaO粉末研細(xì)后加入一定量的水, 不斷攪拌, 緩慢加入一定量的80%的L- 乳酸溶液, 在一定的溫度下反應(yīng), 過(guò)濾和蒸發(fā)濃縮, 轉(zhuǎn)至室溫下放置結(jié)晶, 將得到的結(jié)晶物用無(wú)水乙醇洗滌、抽濾、干燥, 得到白色的五水合L- 乳酸鈣顆粒。

驗(yàn)結(jié)果表明, 條件為牡蠣殼在900 ℃下灰化120 min, 2.00 g 灰分加水40.0 mL 制成石灰乳, 石灰乳中加入12.00 mL 80%的L- 乳酸, 在60 ℃發(fā)生中和反應(yīng), 經(jīng)過(guò)濾、結(jié)晶、洗滌后在55 ℃下干燥制得白色粉末產(chǎn)品。在此工藝條件下產(chǎn)率為92.45%, L- 乳酸鈣含量為89.41%。

參考文獻(xiàn)

[1] 江敏，牡蠣殼合成L-乳酸鈣的工藝研究[J] DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.03.014