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如何從瓊脂糖凝膠中純化DNA

2021/7/28 17:32:59

背景資料

凝膠純化可以根據(jù)大小分離和純化DNA片段。該程序從標準瓊脂糖凝膠電泳開始,根據(jù)堿基對的長度分離DNA。在電泳后,可以從瓊脂糖凝膠中切下DNA條帶,然后純化DNA樣品。這是一種常用的分子克隆技術(shù),例如基于克隆的聚合酶鏈反應或限制性酶。

實驗步驟

1.根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的Protocol做如下修改:

注:凝膠純化可以使用盡可能低濃度的瓊脂糖凝膠(在可分辨的范圍),所以如果可能的話保持在0.7%-0.8%的范圍內(nèi)。

注:需要得到分辨更好的條帶。這可以通過使用更寬的凝膠梳和在較低電壓下運行凝膠來實現(xiàn)。

注:如果想要預留更多的位置來切取條帶和減少DNA污染,可以在樣品-樣品之間預留空泳道。

注:為了減少DNA損傷的風險,限制DNA在紫外線下暴露的時間。

2.一旦凝膠電泳結(jié)束,需要把凝膠移動到一個紫外線箱中(確保適當?shù)淖贤饩€保護--尤其是對你的眼睛!),由于塑料會阻擋大部分紫外線,所以需要從凝膠托盤上取下凝膠,之后用干凈的無菌刀片,從凝膠中切取所需的DNA片段。

注:為了保護紫外線箱,如果可以的話,把凝膠放在玻璃板上是個好主意。與塑料托盤相比,玻璃板將不會顯著減少紫外線,但將保護紫外線盒不被刀片切割。

注:試著將條帶周圍多余的凝膠去除。在DNA純化過程中,這一點尤為重要,因為許多試劑盒不能在一個體系中處理超過固定體積的凝膠。

3.將凝膠放入標記的EP管中。

4.用秤稱量。用空管對體系進行校零,之后對凝膠進行稱重。或者,可以用凝膠管的重量減去空管的重量。凝膠的重量與其液體體積成正比,用于確定在DNA分離過程中每個緩沖液的添加量。

5.最后,需要從凝膠中分離出DNA。這是可以使用商用的凝膠純化試劑盒。遵循相關(guān)說明書完成實驗即可。

注:在使用凝膠純化的DNA進行下一步實驗之前,確定分離出的DNA的濃度通常是很重要的。

提示和常見問題

怎樣才能更好地提高條帶的分辨率?

提高DNA條帶分辨率的幾種簡單方法包括:

(A)在較低電壓下運行較長時間的電泳;

(B)使用更寬的凝膠梳;

(C)在上樣孔中加入較少的DNA。

怎樣才能更好地分離條帶?

如果大小相近的條帶,可以通過調(diào)整凝膠百分比,使之更好的分離。較高比例的瓊脂糖凝膠將有助于分離較小的條帶,而較低百分比的凝膠將有助于分離較大的條帶。

10%規(guī)則:

對于樣品,要比所需的體積多10%,因為可能會在上樣過程中丟失幾個微升。例如,如果要在10μL中加1.0μg的DNA,則在11μL中加入1.1μg。

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