羥苯磺酸鈣（CaD）作為血管保護(hù)性藥物，具有抗炎、抗氧化、抗血管再生作用，在臨床中被廣泛用于治療糖尿病微血管并發(fā)癥，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）、糖尿病腎?。―KD）等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，羥苯磺酸鈣可減少DKD患者蛋白尿，但其具體機(jī)制是什么？天津醫(yī)科大學(xué)朱憲彝紀(jì)念醫(yī)院陳莉明教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)展的一項(xiàng)基礎(chǔ)研究對(duì)此進(jìn)行了深入探索，研究成果發(fā)表于Frontiers in Pharmacology雜志[1]。
研究背景及方法
近期有研究證實(shí)，糖尿病腎病患者的腎組織中多種細(xì)胞的自噬水平異常、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與VEGF受體病理性表達(dá)增多、PI3K/AKT/mTOR通路磷酸化水平異常升高與白蛋白尿的產(chǎn)生有緊密聯(lián)系。羥苯磺酸鈣作為微血管保護(hù)劑，改善DKD的機(jī)制究竟是什么？基于此疑問(wèn)，特開(kāi)展本研究來(lái)探討羥苯磺酸鈣對(duì)糖尿病小鼠白蛋白尿的作用，探究其對(duì)小鼠腎臟內(nèi)自噬活性的作用，同時(shí)證明其可能作用的信號(hào)通路。
該研究應(yīng)用KK-Ay自發(fā)性糖尿病小鼠和HFD/STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠DKD模型，分別取半數(shù)小鼠給予羥苯磺酸鈣試劑灌胃治療12周，其余小鼠以同樣方式給予純水灌胃12周，C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組。觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法包括：
1.一般情況及生化指標(biāo)：包括空腹血糖、尿微量白蛋白排泄率（UAE）、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶等；
2.組織形態(tài)學(xué)：通過(guò)HE染色、PAS染色、Masson染色方法檢測(cè)腎小球及腎小管間質(zhì)的組織形態(tài)學(xué)變化，并測(cè)算腎小球平均容量；
3.免疫組化方法檢測(cè)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)性蛋白Nephrin和Podocin的表達(dá)情況；
4.免疫組化和Western blot凝膠電泳實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)腎組織中自噬相關(guān)蛋白（LC3、ATG-5、Beclin-1、P62）在腎組織中的表達(dá)情況；
5.Western blot方法檢測(cè)小鼠腎臟中VEGF及其受體2、PI3K/AKT/mTOR自噬相關(guān)通路磷酸化蛋白與總蛋白的相對(duì)表達(dá)情況。
總的來(lái)說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路就是通過(guò)觀察蛋白尿變化→腎結(jié)構(gòu)變化→蛋白尿生成的關(guān)鍵細(xì)胞→影響蛋白表達(dá)的通路，層層遞進(jìn)、抽絲剝繭，揭示羥苯磺酸鈣的可能機(jī)制。
研究結(jié)果
01.羥苯磺酸鈣顯著降低DKD小鼠的蛋白尿
在兩種糖尿病腎病小鼠模型中，羥苯磺酸鈣治療均可顯著減少DKD小鼠升高的尿白蛋白排泄率：KK-Ay小鼠和HFD/STZ小鼠中，UAE（μg/24h）分別為7.11 vs. 11.23和0.37 vs. 2.13（均P<0.05）。
而且，羥苯磺酸鈣治療后的DKD小鼠空腹血糖、體重、血肌酐、總膽固醇、甘油三酯、谷丙轉(zhuǎn)氨酶與未治療的小鼠相比無(wú)明顯差異（均P>0.05），提示羥苯磺酸鈣對(duì)糖脂代謝等無(wú)明顯影響。
02.羥苯磺酸鈣減輕腎組織破壞
DKD小鼠腎臟組織中結(jié)構(gòu)模糊，腎小球結(jié)構(gòu)不規(guī)則、體積增大，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，近段腎小管呈空泡樣變性，細(xì)胞核形態(tài)不一，系膜區(qū)膨脹，腎小球與腎小管間質(zhì)中的纖維化明顯。經(jīng)羥苯磺酸鈣治療后，DKD小鼠腎臟組織中上述組織形態(tài)變化有明顯改善。
03.羥苯磺酸鈣保護(hù)足細(xì)胞，修復(fù)濾過(guò)膜損傷
一旦足細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，腎小球?yàn)V過(guò)膜的屏障就會(huì)被破壞，蛋白漏出而產(chǎn)生蛋白尿。Nephrin和Podocin作為足細(xì)胞特異性蛋白，其表達(dá)情況可反映濾過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能是否正常。
DKD小鼠的腎組織中，Nephrin和Podocin的表達(dá)含量下降，提示濾過(guò)膜損傷嚴(yán)重。羥苯磺酸鈣治療組小鼠的腎組織中，Nephrin和Podocin的表達(dá)含量明顯恢復(fù)（P<0.05），提示羥苯磺酸鈣對(duì)足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)具有一定的保護(hù)作用，可修復(fù)濾過(guò)膜損傷。
04.羥苯磺酸鈣恢復(fù)DKD小鼠腎臟自噬活性
自噬是真核細(xì)胞循環(huán)利用的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，以處理各種應(yīng)激條件下的分解產(chǎn)物和無(wú)用物質(zhì)，從而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。近年來(lái)研究表明，糖尿病小鼠出現(xiàn)蛋白尿通常伴有足細(xì)胞特異性自噬缺陷。自噬的藥理學(xué)誘導(dǎo)對(duì)于改善糖尿病患者腎功能具有很好的治療潛力。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定了DKD進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生的自噬改變，并驗(yàn)證羥苯磺酸鈣的確可改變自噬。與DKD小鼠相比，經(jīng)羥苯磺酸鈣治療后的小鼠LC3、Beclin-1、ATG-5自噬相關(guān)蛋白在腎小球和腎小管間質(zhì)內(nèi)的表達(dá)含量顯著增多，P62蛋白表達(dá)降低（P<0.05），提示自噬水平恢復(fù)。
05.羥苯磺酸鈣降低VEGF和VEGFR-2表達(dá)，抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路
在高血糖等應(yīng)激條件下，VEGF及其受體2（VEGFR-2）過(guò)度表達(dá)，可通過(guò)誘導(dǎo)血管生成和血管通透性增加進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷。該研究證實(shí)，羥苯磺酸鈣可降低DKD小鼠腎臟中增多的VEGF與VEGFR-2表達(dá)含量（P<0.05）。
PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路作為VEGFR-2下游的信號(hào)通路之一，其在高血糖時(shí)磷酸化水平增高。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥苯磺酸鈣治療后，該通路磷酸化水平明顯下降（P<0.05），提示該藥可能通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR途徑來(lái)下調(diào)VEGF/VEGFR-2的活化以及恢復(fù)自噬水平。
根據(jù)以上結(jié)果，構(gòu)建出羥苯磺酸鈣干預(yù)的假設(shè)路徑如下。
從研究意義看羥苯磺酸鈣的臨床應(yīng)用
DKD是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要因素。迄今為止，DKD尚無(wú)治愈策略，因此迫切需要探索其發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)出特異性的有效治療方法。腎損傷可由多種因素導(dǎo)致，微血管病變被認(rèn)為是主要病理生理機(jī)制，因而維持DKD早期微血管的結(jié)構(gòu)和功能，減少蛋白尿，對(duì)保護(hù)腎功能至關(guān)重要。
既往研究已證實(shí)羥苯磺酸鈣能減少DKD患者的蛋白尿，但知其然也要知其所以然，有必要對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入探討。本研究首次證明，在KK-Ay小鼠和HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，羥苯磺酸鈣通過(guò)VEGF/PI3K/Akt/mTOR通路恢復(fù)自噬，減少蛋白尿。這為羥苯磺酸鈣的臨床獲益提供了新的理論基礎(chǔ)。
實(shí)際上，羥苯磺酸鈣最早用于DR的治療，但DR和DKD通常相伴發(fā)生，兩者的發(fā)病機(jī)制也有相似之處。羥苯磺酸鈣能同時(shí)治療DR和DKD，起到“一石二鳥(niǎo)”的作用，對(duì)糖尿病患者來(lái)說(shuō)非常有意義。
臨床實(shí)踐中，無(wú)論是DR還是DKD，均應(yīng)重視早期篩查，早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)對(duì)于預(yù)防疾病進(jìn)展至關(guān)重要。在疾病早期階段就起始羥苯磺酸鈣，可更好地發(fā)揮藥物的視網(wǎng)膜和腎臟保護(hù)作用。此外，基于臨床研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，該藥對(duì)微血管的修復(fù)作用需要一段時(shí)間的積累，病情改善通常至少需要3個(gè)月至半年，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。由于隨著病程延長(zhǎng)，DR和DKD病情也在不斷進(jìn)展，微血管保護(hù)劑的治療也應(yīng)長(zhǎng)期堅(jiān)持，即早期起始、全程應(yīng)用，以使藥物盡可能發(fā)揮出保護(hù)作用。
結(jié)語(yǔ)
本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在糖尿病腎病小鼠體內(nèi)，羥苯磺酸鈣通過(guò)恢復(fù)自噬水平，降低腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性，從而顯著減少白蛋白尿的產(chǎn)生，此作用可能與羥苯磺酸鈣抑制了VEGF/VEGFR-2和PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。這次探索進(jìn)一步揭示了羥苯磺酸鈣的作用機(jī)制，在知其所以然之后，臨床早期、全程應(yīng)用微血管保護(hù)劑的策略就有了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：1. Wang Y, Lu YH, Tang C, Xue M, Li XY, Chang YP, Cheng Y, Li T, Yu XC, Sun B, Li CJ, Chen LM. Calcium Dobesilate Restores Autophagy by Inhibiting the VEGF/PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2019 Aug 9; 10: 886. doi: 10.3389/fphar.2019.00886.