背景及概述^[1]

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，簡稱EC），是一種具有遺傳毒性及致癌性的物質(zhì)，對嚙齒類動物，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病。EC廣泛存在于發(fā)酵食品（如醬油、腐乳等）、釀造酒（如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等）和蒸餾酒（如白蘭地、威士忌等）中，主要通過酒精類飲料的攝入進(jìn)入人體內(nèi)。研究表明氨基甲酸乙酯在生物體內(nèi)約有0.5%被細(xì)胞色素P450氧化為乙?；被姿嵋阴?，再進(jìn)一步形成乙?；被姿嵋阴キh(huán)氧化物，此種物質(zhì)能夠在生物體內(nèi)形成DNA加聚物，導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)的雙鏈被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞癌變；另有0.1%左右的氨基甲酸乙酯被細(xì)胞色素P450氧化為N-羥基氨基甲酸乙酯，這種物質(zhì)誘導(dǎo)Cu²⁺調(diào)控的DNA損傷，引起癌變。

早在1985年，加拿大衛(wèi)生與預(yù)防部門對酒精類飲料中的氨基甲酸乙酯含量做了強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)，隨后世界其他國家也先后制定了各種飲料酒中的限量標(biāo)準(zhǔn)。同時，采取減少和去除食品中EC前體物質(zhì)、選用選擇性強(qiáng)和特性良好的能降低發(fā)酵過程中尿素排泄量的菌株、對發(fā)酵過程和蒸餾過程進(jìn)行工藝改良、對發(fā)酵酒進(jìn)行脲酶和EC降解酶酶法后處理等方法降低成品中EC的含量。各種檢測飲料酒以及其他發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的方法也不斷發(fā)明和改善。

現(xiàn)階段檢測氨基甲酸乙酯含量的方法主要有：薄層分析法、傅立葉變換近紅外光譜法(FTIR)，近紅外光譜技術(shù)(NIR)，氣相色譜分析法(GC)，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC/MS/MS)，氣相二維或多維色譜-穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/GC/CIMS)，氣相色譜/熱離子檢測器法(GC/TSD)，高效液相色譜(HPLC)以及高效液相-熒光法(HPLC-FLD)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC/MS/MS)等。

含量檢測^[1]

CN201410533042.1報道了一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法，步驟為：

（1）構(gòu)建雙酶偶聯(lián)催化體系

a、酶源：氨基甲酸乙酯降解酶，對氨基甲酸乙酯EC降解酶產(chǎn)生菌菌株CGMCC NO.5763細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)超聲破碎、離心、濃縮、凝膠層析、超濾濃縮后所得；谷氨酸脫氫酶則為市售商品酶；

b、酶液以及其他溶液的制備：用25mmol·L^-1 PBS緩沖液溶解氨基甲酸乙酯降解酶以及谷氨酸脫氫酶，使得二者酶活分別為16U·mL^-1和10U·mL^-1；配制540mmol·L^-1α-酮戊二酸溶液；7.5mmol·L^-1NADH以及不同濃度的氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液；

c、雙酶偶聯(lián)體系的構(gòu)建：向反應(yīng)體系中分別加入20μL上述氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶溶解液，66μL的α-酮戊二酸溶液，20μL NADH溶液，20μL 1mmol·L^-1氨基甲酸乙酯溶液和454μL PBS緩沖液，使得總反應(yīng)體系體積為600μL，置于石英比色皿中混合均勻；然后將此反應(yīng)體系置于分光光度計中用動力學(xué)方法監(jiān)測溶液中NADH在340nm處吸光值的變化情況；

（2）雙酶偶聯(lián)體系對氨基甲酸乙酯含量的快速測定：

d、用純度大于99%的氨基甲酸乙酯配制濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5和1 mmol·L-1的母液；

e、向雙酶偶聯(lián)體系中加入適當(dāng)體積和濃度的氨基甲酸乙酯母液使得反應(yīng)體系中氨基甲酸乙酯濃度分別為0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50 μmol·L^-1；將所得的溶液體系混合均勻后置于分光光度計中用動力學(xué)方法監(jiān)測NADH在340 nm處吸光值的變化，反應(yīng)時間為5min；將EC的濃度與340nm處吸光值在5min內(nèi)的變化制作得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示；

f、向模擬黃酒樣品（通過向pH 6.0，25 mmol·L^-1PBS緩沖液中添加無水乙醇制備模擬黃酒，酒精度為15%）中添加一定量的氨基甲酸乙酯母液，在雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中反應(yīng)5 min后檢測NADH在340nm處的吸光值變化，通過對比標(biāo)準(zhǔn)曲線計算模擬酒樣中氨基甲酸乙酯含量。

建立的方法能夠快速檢測并準(zhǔn)確定量溶液樣品中的氨基甲酸乙酯含量。在模擬黃酒樣品中的檢測限為0.1 μmol·L^-1，線性相關(guān)系數(shù)為0.995，樣品回收率為95.54%-100.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.634%-4.611%（表1）。

表1檢測模擬黃酒樣品中氨基甲酸乙酯的回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)差

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過對雙酶偶聯(lián)體系中最適緩沖體系、氨基甲酸乙酯降解酶和谷氨酸脫氫酶最適添加量、α-酮戊二酸最適反應(yīng)濃度等多個實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了快速實時檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法。該方法具有靈敏、快速、簡捷、無需昂貴的儀器和復(fù)雜繁瑣的操作工序等優(yōu)點，克服了以往方法中的諸多不足。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201410533042.1 一種快速檢測氨基甲酸乙酯含量的分光光度方法