背景及概述[1]
左旋肉堿或L-肉堿,別稱L-肉毒堿或維生素BT,其化學(xué)名稱為β-羥基γ-三甲銨丁酸,是一種白色晶狀體或白色透明細(xì)粉。肉堿的研究始于20世紀(jì)初期。1905年,俄國(guó)人Gulewitsch和Krimberg從肉類提取物中發(fā)現(xiàn)了L-肉堿。自此以后,各國(guó)科學(xué)家進(jìn)行了深入的研究,早期的研究發(fā)現(xiàn),L-肉堿是一種類維生素營(yíng)養(yǎng)素,并將其命名為維生素BT。而事實(shí)上,肉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于膽堿,與氨基酸相近;另外,由于一些動(dòng)物可由自身合成來(lái)滿足肉堿的需要,因此認(rèn)為肉堿不是維生素,但習(xí)慣上仍將其稱為維生素BT。實(shí)驗(yàn)表明L-肉堿是一種必需營(yíng)養(yǎng)素,1985年在芝加哥召開(kāi)的國(guó)際營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議上,將左旋肉堿指定為“多功能營(yíng)養(yǎng)品”。
制備[1]
步驟1:催化劑[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl的制備。
取市場(chǎng)上采購(gòu)的手性配體S-BINAP(0.535g,0.85mmol)和釕化合物[Ru(p-cymene)Cl2]2(0.29g,0.47mmol)于三頸瓶中,在N2保護(hù)下加入無(wú)水乙醇60mL和CH2Cl220mL,升溫至50-60℃攪拌反應(yīng)20h,減壓除溶劑后,得0.87g紅棕色產(chǎn)物[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl[氯代[(S)-(-)-2,2′-雙(二苯基膦)-1,1′-聯(lián)萘](p-傘花素)氯化釕(II)]。
步驟2:中間體(R)-(-)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的制備。
取80g的4-氯乙酰乙酸乙酯于裝備聚四氟襯管的高壓釜中,將高壓釜封閉好后,用5kgf/cm2的純H2(99.99%)洗高壓釜10余次后,向高壓釜中充氫待用。在H2氣氛下將催化劑[RuCl(cymene)(S-BINAP)]Cl(30mg)溶解于300mL的乙酸乙酯溶液中,用注射器小心將其加入高壓釜中,繼續(xù)充氫至5kgf/cm2后,升溫至80℃左右,靜置約20min后,開(kāi)始攪拌,在此溫度下反應(yīng)6h后,停止反應(yīng),取出物料后經(jīng)減壓蒸餾除去低級(jí)烷基酯類溶劑即得高純度產(chǎn)品。經(jīng)GC分析產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化率大于99%,ee值96%。
步驟3:左旋肉堿的制備。
取上述產(chǎn)物-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(4.5g)于圓底燒瓶中,加入33%Me3N20mL,用翻口橡皮塞密封,升溫至80℃,攪拌反應(yīng)5h,停止反應(yīng),減壓蒸餾除去未反應(yīng)的Me3N后,加入10%的鹽酸溶液40mL,繼續(xù)在100℃下攪拌反應(yīng)6h,冷至室溫,加入CH2Cl220mL,室溫下攪拌過(guò)夜,分離收集水溶液,真空旋干,得棕褐色粘稠狀粗產(chǎn)物。
取預(yù)先制備好的陰離子交換樹(shù)脂約200-300mL,參照硅膠濕法裝好樹(shù)脂柱,在頂層小心放置一層玻璃纖維,將上述粘稠狀粗產(chǎn)物倒入裝好的柱中,用去離子水淋洗,控制滴液速度大約為1-2mL/min,當(dāng)流出溶液的pH>8時(shí)開(kāi)始收集,收集至流出液的pH約為8時(shí)停止收集。將所得的溶液減壓抽干。用乙醇/丙酮(1/7)重結(jié)晶,得到無(wú)色針狀晶體(左旋肉堿),將所得肉堿產(chǎn)品于60-80℃下真空干燥1-2小時(shí)即得純品,產(chǎn)量4.0g,收率為86%。測(cè)定上述所得產(chǎn)品的比旋光度為,[α]D23-30.1。
含量檢測(cè)[2]
1、試劑準(zhǔn)備
高氯酸溶液(13%):13mL高氯酸稀釋至100mL。
氫氧化鈉溶液(10mol/L):稱取40g氫氧化鈉用水溶解,冷卻后稀釋至100mL。
氫氧化鉀溶液(4.0mol/L):稱取22.4g氫氧化鉀用水溶解,冷卻后稀釋至100mL。
顯色儲(chǔ)備液:分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中,用10mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4~7.6,然后用水定容至50mL。此液置于4℃冰箱中可保存3個(gè)月。
顯色工作液:吸取5.0mL顯色儲(chǔ)備液用水定容至25mL。
乙酰輔酶A(AcetylCoA)溶液:20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中。臨用時(shí)配制。
乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶(CAT)溶液:吸取10μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液,經(jīng)1500r/min離心10min,棄去上層清液,沉淀用0.2mL水溶解。臨用時(shí)配制。
左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品,sigma,純度99%。配制成5個(gè)濃度備用,現(xiàn)配現(xiàn)用,分別是1.6,3.2,6.4,9.6,16ug/ml。
2、儀器
分析天平:萬(wàn)分之一。
pH計(jì):精度0.01。
離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥1500r/min。
恒溫水浴鍋:溫度可控制在40℃±2℃。
酶標(biāo)儀405nm及配套的96孔酶標(biāo)板。
3、樣品處理
準(zhǔn)確稱取2.5g混合均勻的試樣于帶刻度的50ml離心管中,用15mL40℃溫水溶解。加入5mL13%高氯酸溶液,混合均勻后靜止20min。用蒸餾水定容至刻度,混勻,用定量濾紙過(guò)濾。
取濾液20mL,用4mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)pH為12.5~13.0后,置于40℃水浴60min。冷卻后用13%高氯酸調(diào)pH為7.0~7.5。將樣液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中,用蒸餾水定容?;靹蚝笾糜?℃冰箱中過(guò)夜。將試樣處理液從冰箱中取出放置至室溫,取上清液測(cè)定。
4、分析測(cè)定
在酶標(biāo)板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔5個(gè)(1.6,3.2,6.4,9.6,16)和樣品孔,雙孔平行測(cè)試;
取200ul標(biāo)品或樣品加入到相應(yīng)的微孔中;
加入80ul底物到各個(gè)孔,加入10ul輔酶A到各個(gè)孔。輕輕混勻,立刻開(kāi)始計(jì)時(shí)5分鐘,室溫;
在405nm讀取吸光度OD1;
每孔加入10ul轉(zhuǎn)移酶溶液,混勻(輕輕攪拌效果好),計(jì)時(shí)10分鐘,室溫;
用酶標(biāo)儀405nm測(cè)試吸光度OD2。
5、結(jié)果計(jì)算
用吸光度差(OD2-OD1)作縱坐標(biāo),濃度值為橫坐標(biāo),作圖,從圖中讀出樣品濃度,乘以稀釋倍數(shù)(稀釋倍數(shù)50)得最終結(jié)果。
本方法對(duì)國(guó)標(biāo)法進(jìn)行了改進(jìn),使得左旋肉堿測(cè)定更加快捷方便。一是本方法所用到的試劑屬于酶類制劑,價(jià)格比較高,用酶標(biāo)板孔進(jìn)行反應(yīng)所需的試劑量是原來(lái)的十分之一,可以大大節(jié)約關(guān)鍵試劑的用量及成本。二是本發(fā)明方法可以一次性測(cè)試96孔的吸光度,節(jié)省很多時(shí)間,而分光度計(jì)每次只能測(cè)一個(gè)樣的吸光度值,因而能達(dá)到一個(gè)快速檢測(cè)的目標(biāo),例如測(cè)定10個(gè)樣品時(shí),本發(fā)明方法相對(duì)國(guó)標(biāo)法可以節(jié)省210分鐘。
參考文獻(xiàn)
[1][中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)]CN201210089733.8一種左旋肉堿的制備方法
[2][中國(guó)發(fā)明]CN201810498612.6一種乳粉中左旋肉堿含量的檢測(cè)方法