質(zhì)粒中量抽提試劑盒(通用型)

信裕生物的質(zhì)粒中量抽提試劑盒(通用型) (Plasmid Midi Preparation Kit for All Purpose, Plasmid Midiprep Kit for All Prupose)是一種用于從大腸桿菌中進(jìn)行中量質(zhì)?？焖俪樘岬耐ㄓ眯碗x心柱式試劑盒。
本試劑盒不僅適用于常用的EndA^-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也適用于EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA⁺菌株中高豐度核酸酶的污染，并適用于從糖類修飾水平高的野生菌株中提取質(zhì)粒。
野生型大腸桿菌中表達(dá)Endonuclease I，能切割并降解雙鏈DNA。編碼Endonuclease I的基因是endA，如果endA突變失活，其基因型會被標(biāo)注為endA1，相應(yīng)的突變菌株被稱為EndA^-菌株，而野生型菌株則被稱為EndA⁺菌株。常見的EndA^-和EndA⁺菌株參見附表1。從EndA⁺菌株中抽提的質(zhì)粒，微量核酸酶和質(zhì)粒結(jié)合而容易被共純化，導(dǎo)致容易降解，而本試劑盒增加了特殊的洗滌步驟(核酸酶洗滌液溶液PB洗滌)，可以有效避免EndA⁺菌株中抽提獲得的質(zhì)粒容易降解的問題(參考圖1)。

圖1. 使用溶液PB可以使從EndA⁺菌株JM110中抽提的質(zhì)粒不易降解，而對于EndA^-菌株DH5α中抽提的質(zhì)粒沒有影響。使用本試劑盒時，如上圖所示，在使用和不使用溶液PB時的質(zhì)粒得率一致。但對于EndA⁺菌株JM110，不使用溶液PB時從其中抽提獲得的質(zhì)粒在內(nèi)切酶緩沖液Buffer Y中37℃孵育1小時后會全部降解，而使用溶液PB時同樣孵育1小時就不會降解。對于EndA^-菌株DH5α無論是否使用溶液PB，抽提獲得的質(zhì)粒的都很穩(wěn)定。

本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需不足60分鐘即可完成。
無需高速冷凍離心機(jī)，只需普通臺式高速離心機(jī)。所有操作均可在1.5ml離心管中完成。 
每個質(zhì)粒純化柱可以結(jié)合的質(zhì)粒量的上限約為50微克。每個純化柱可用于抽提5-10毫升用LB培養(yǎng)過夜的大腸桿菌。抽提所得質(zhì)粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提獲得的質(zhì)粒量會受質(zhì)?？截悢?shù)等因素影響。抽提獲得的質(zhì)粒DNA的OD260和OD280比值也會因菌種不同等原因而略有波動。
本試劑盒抽提所得到的質(zhì)?？芍苯佑糜谵D(zhuǎn)染細(xì)胞，DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，內(nèi)切酶消化等。本試劑盒在使用溶液PB的情況下，獲得的質(zhì)粒的純度更高，內(nèi)毒素含量低，總體上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率會顯著提高。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。加入RNase A后4℃存放。
次使用前在溶液IV (洗滌液)中加入27ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。 
溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。
溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。
溶液II有強(qiáng)堿性，溶液II、溶液III、溶液PB和溶液IV對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 取過夜菌至3個1.5毫升離心管中，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過5毫升，對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過10毫升。過量的細(xì)菌會導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。 
2. 每管加入250微升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團(tuán)塊。
確認(rèn)溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液，無明顯細(xì)菌團(tuán)塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。 
3. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變得透明，無團(tuán)塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團(tuán)塊或絮狀物。遇到有少量團(tuán)塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。 
4. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。 
5. 最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會產(chǎn)生白色沉淀。離心時準(zhǔn)備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標(biāo)記。 
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。最高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。再重復(fù)兩次，使三管質(zhì)粒結(jié)合于同一純化柱上。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。 
7. (可選做)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入500微升溶液PB，最高速離心30-60秒，洗去核酸酶污染等雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
本步驟對于從EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等中提取質(zhì)粒并去除核酸酶污染是必須的，對于從其它任何具有較高核酸酶表達(dá)水平和糖類修飾水平的菌株中提取質(zhì)粒也是非常必須的。參考圖1，對于一些常用的EndA^-菌株如DH5α和XL-1 blue等如果后續(xù)僅用于酶切、PCR、反轉(zhuǎn)錄等常規(guī)分子生物學(xué)操作，并不需要本步驟。如果抽提獲得的質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，宜增加本步驟。 
8. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。 
9. 最高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。 
10. 將質(zhì)粒純化柱置于潔凈1.5毫升離心管上，加入120微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。
溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震動離心管，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q級純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會略有幫助。 
11. 最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用常規(guī)的乙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒。 
附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.