質(zhì)粒大量抽提試劑盒(通用型)

信裕生物的質(zhì)粒大量抽提試劑盒(通用型) (Plasmid Maxi Preparation Kit for All Purpose, Plasmid Maxiprep Kit for All Purpose)是一種用于從大腸桿菌中進行大量質(zhì)粒快速抽提的通用型離心柱式試劑盒。
本試劑盒不僅適用于常用的EndA^-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也適用于EndA⁺菌株如JM110、BL21 (DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA⁺菌株中高豐度核酸酶的污染，并適用于從糖類修飾水平高的野生菌株中提取質(zhì)粒。
野生型大腸桿菌中表達(dá)Endonuclease I，能切割并降解雙鏈DNA。編碼Endonuclease I的基因是endA，如果endA突變失活，其基因型會被標(biāo)注為endA1，相應(yīng)的突變菌株被稱為EndA^-菌株，而野生型菌株則被稱為EndA⁺菌株。常見的EndA^-和EndA⁺菌株參見附表1。從EndA⁺菌株中抽提的質(zhì)粒，微量核酸酶和質(zhì)粒結(jié)合而容易被共純化，導(dǎo)致容易降解，而本試劑盒增加了特殊的洗滌步驟(核酸酶洗滌液溶液PB洗滌)，可以有效避免EndA⁺菌株中抽提獲得的質(zhì)粒容易降解的問題(參考圖1)。

圖1. 使用溶液PB可以使從EndA⁺菌株JM110中抽提的質(zhì)粒不易降解，而對于EndA^-菌株DH5α中抽提的質(zhì)粒沒有影響。使用本試劑盒時，如上圖所示，在使用和不使用溶液PB時的質(zhì)粒得率一致。但對于EndA⁺菌株JM110，不使用溶液PB時從其中抽提獲得的質(zhì)粒在內(nèi)切酶緩沖液Buffer Y中37℃孵育1小時后會全部降解，而使用溶液PB時同樣孵育1小時就不會降解。對于EndA^-菌株DH5α無論是否使用溶液PB，抽提獲得的質(zhì)粒的都很穩(wěn)定。

本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，6個樣品只需不足90分鐘即可完成。
每個質(zhì)粒純化柱可以結(jié)合的質(zhì)粒量的上限約為500微克。每個純化柱可用于抽提約100毫升用LB培養(yǎng)過夜的大腸桿菌。抽提所得質(zhì)粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提獲得的質(zhì)粒量會受質(zhì)?？截悢?shù)等因素影響。抽提獲得的質(zhì)粒DNA的OD260和OD280比值也會因菌種不同等原因而略有波動。
本試劑盒抽提所得到的質(zhì)?？芍苯佑糜谵D(zhuǎn)染細(xì)胞，DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，內(nèi)切酶消化等。本試劑盒在使用溶液PB的情況下，獲得的質(zhì)粒的純度更高，內(nèi)毒素含量低，總體上轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率會顯著提高。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項：
次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。加入RNase A后4℃存放。
次使用前請根據(jù)說明書和瓶上的標(biāo)示，在每瓶溶液IV (洗滌液)中加入150ml無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標(biāo)記。
溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。
溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。
溶液II有強堿性，溶液II、溶液III、溶液PB和溶液IV對人體都有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 取過夜菌至50毫升離心管內(nèi)，5000g離心1分鐘收集細(xì)菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約50毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過150毫升，對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過200毫升。過量的細(xì)菌會導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團塊。
確認(rèn)溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液，無明顯細(xì)菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開，或手指把沉淀彈開。
3. 每管加入5毫升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，室溫放置1-2分鐘，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。
4. 每管加入7毫升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。
5. 12,000-14,000rpm)室溫離心10分鐘。
如果離心機的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心20-30分鐘或更長時間，直至沉淀充分。離心時可以準(zhǔn)備好質(zhì)粒純化柱，自制漏斗等，并在純化柱上標(biāo)上記號。
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。12,000-14,000rpm離心2分鐘，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。本步驟及后續(xù)需要12,000-14,000rpm離心2分鐘的步驟，如果離心機的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時間，例如約5000-6000rpm時需要離心約5分鐘或更長時間，直至液體全部穿柱。如果離心后有少量漂浮物，可以考慮再次離心，或者使用擦鏡紙兩次對折后打開形成的自制漏斗，以過濾去除漂浮物。
7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm離心2分鐘，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。
8. 12,000-14,000rpm再次離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。
9. 將質(zhì)粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置2分鐘。
也可以用重蒸水或MilliQ級純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒，可以加入1毫升溶液V洗脫，質(zhì)粒得率實測減少約5-10%，具體減少量與特定樣品有關(guān)。
10. 12,000-14,000rpm離心2分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級超純質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右，可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)?；虺Ｒ?guī)的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇)，混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒，在洗脫時推薦采用1毫升洗脫液進行洗脫，后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進行異丙醇沉淀，這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀，和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔，避免沉淀松動或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清，直接倒棄上清時經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況；如果偏好直接倒棄上清，建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi)，這樣萬一沉淀被倒出，仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清，并注意盡量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常溫70%乙醇溶液，輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌，12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體，避免觸及沉淀。
d. 肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥)，加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥，否則很難溶解。在弱堿性條件下溶解DNA，溶解時可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。

附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.

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