質(zhì)粒小量抽提試劑盒(通用型)

信裕生物的質(zhì)粒小量抽提試劑盒(通用型) (Plasmid Mini Preparation Kit for All Purpose, Plasmid Miniprep Kit for All Purpose)是一種用于從大腸桿菌中進行小量質(zhì)?？焖俪樘岬耐ㄓ眯碗x心柱式試劑盒。
本試劑盒不僅適用于常用的EndA^-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等，也適用于EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，能有效避免EndA⁺菌株中高豐度核酸酶的污染，并適用于從糖類修飾水平高的野生菌株中提取質(zhì)粒。
野生型大腸桿菌中表達Endonuclease I，能切割并降解雙鏈DNA。編碼Endonuclease I的基因是endA，如果endA突變失活，其基因型會被標注為endA1，相應(yīng)的突變菌株被稱為EndA^-菌株，而野生型菌株則被稱為EndA⁺菌株。常見的EndA^-和EndA⁺菌株參見附表1。從EndA⁺菌株中抽提的質(zhì)粒，微量核酸酶和質(zhì)粒結(jié)合而容易被共純化，導(dǎo)致容易降解，而本試劑盒增加了特殊的洗滌步驟(核酸酶洗滌液溶液PB洗滌)，可以有效避免EndA⁺菌株中抽提獲得的質(zhì)粒容易降解的問題(參考圖1)。

圖1. 使用溶液PB可以使從EndA⁺菌株JM110中抽提的質(zhì)粒不易降解，而對于EndA^-菌株DH5α中抽提的質(zhì)粒沒有影響。使用本試劑盒時，如上圖所示，在使用和不使用溶液PB時的質(zhì)粒得率一致。但對于EndA⁺菌株JM110，不使用溶液PB時從其中抽提獲得的質(zhì)粒在內(nèi)切酶緩沖液Buffer Y中37℃孵育1小時后會全部降解，而使用溶液PB時同樣孵育1小時就不會降解。對于EndA^-菌株DH5α無論是否使用溶液PB，抽提獲得的質(zhì)粒的都很穩(wěn)定。

本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質(zhì)粒能在離心過柱的瞬間，結(jié)合到質(zhì)粒純化柱上，在一定條件下又能將質(zhì)粒充分洗脫，從而實現(xiàn)質(zhì)粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需不足30分鐘即可完成。
每個質(zhì)粒純化柱可以結(jié)合的質(zhì)粒量的上限約為20微克。每個純化柱可用于抽提1-5毫升用LB培養(yǎng)過夜的大腸桿菌。抽提所得質(zhì)粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提獲得的質(zhì)粒量會受質(zhì)?？截悢?shù)等因素影響。抽提獲得的質(zhì)粒DNA的OD260和OD280比值也會因菌種不同等原因而略有波動。
本試劑盒抽提所得到的質(zhì)?？芍苯佑糜谵D(zhuǎn)染細胞，DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細菌，內(nèi)切酶消化等。本試劑盒在使用溶液PB的情況下，獲得的質(zhì)粒的純度更高，內(nèi)毒素含量低，總體上轉(zhuǎn)染細胞的效率會顯著提高。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項：
次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標記。加入RNase A后4℃存放。
次使用前請根據(jù)說明書和瓶上的標示，在溶液IV (洗滌液)中加入相應(yīng)體積的無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。
溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。
溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。
溶液II有強堿性，溶液II、溶液III、溶液PB和溶液IV對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 取過夜菌1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復(fù)一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過5毫升，對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量一般不能超過10毫升。過量的細菌會導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。 
2. 每管加入250微升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。
確認溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。 
3. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。 
4. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。 
5. 最高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會產(chǎn)生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質(zhì)粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。 
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。最高速離心30-60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。 
7. (可選做)在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入500微升溶液PB，最高速離心30-60秒，洗去核酸酶污染等雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
本步驟對于從EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等中提取質(zhì)粒并去除核酸酶污染是必須的，對于從其它任何具有較高核酸酶表達水平和糖類修飾水平的菌株中提取質(zhì)粒也是非常必須的。參考圖1，對于一些常用的EndA^-菌株如DH5α和XL-1 blue等如果后續(xù)僅用于酶切、PCR、反轉(zhuǎn)錄等常規(guī)分子生物學(xué)操作，并不需要本步驟。如果抽提獲得的質(zhì)粒用于細胞轉(zhuǎn)染，宜增加本步驟。 
8. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入750微升溶液IV，最高速離心30-60秒，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。 
9. 再最高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質(zhì)粒的質(zhì)量。 
10. 將質(zhì)粒純化柱置于潔凈1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。
溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震動離心管，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 Milli-Q級純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒，可以加入35微升溶液V洗脫。 
11. 最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用常規(guī)的乙醇沉淀方法濃縮質(zhì)粒。 
附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.

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