T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase即T4 DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5'-P末端和3'-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子。同時(shí)T4 DNA 連接酶可以修補(bǔ)雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺刻(single-strand nicks)。
用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和載體、linker或adaptor等的連接。也可以用于缺刻修復(fù)及Ligase介導(dǎo)的RNA檢測(cè)。
來(lái)源：本T4 DNA Ligase由大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)基因的來(lái)源為T4嗜菌體。
活性定義：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM (300 μg/ml)。200U等于1個(gè)Weiss unit，以Weiss unit計(jì)，本產(chǎn)品共200單位。
T4 DNA Ligase連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)后涂板LB平板的效果參考圖1。

圖1. 本T4 DNA Ligase的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后涂板獲得的LB平板效果圖。A. 雙酶切后的載體純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，滿足常規(guī)連接反應(yīng)要求。
酶儲(chǔ)存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50% (v/v) glycerol。
10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
失活或抑制：65℃孵育10分鐘可以導(dǎo)致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl濃度大于200mM時(shí)強(qiáng)烈抑制T4 DNA Ligase。

包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
對(duì)于普通的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作，不必對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接產(chǎn)物可以直接用于轉(zhuǎn)化。但用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通常宜先用DNA純化試劑盒或酚氯仿抽提方法等純化DNA，然后再進(jìn)行電轉(zhuǎn)。
需進(jìn)行平端連接或快速連接時(shí)，推薦使用信裕生物的快速DNA連接試劑盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase可以進(jìn)行平端連接，但效率較低。
普通連接反應(yīng)不必進(jìn)行凝膠電泳觀察。如果需要對(duì)于連接產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳觀察，推薦先在65℃孵育10分鐘使
T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA結(jié)合導(dǎo)致的條帶位置遷移(band shift)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。則可以取連接過(guò)夜的剩余連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 
e. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。
3. Linker或RNAi片段和載體的連接：
a. 載體的酶切和純化同步驟1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以選擇適當(dāng)?shù)腄NA退火緩沖液，例如信裕生物的
Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 進(jìn)行退火反應(yīng)。
c. 長(zhǎng)度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和載體進(jìn)行連接反應(yīng)。例如載體為0.03pmol，則插入片
段可以為0.15至0.3pmol。長(zhǎng)度小于8bp的linker，比例需調(diào)整為10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，隨后按照步驟1e-1h進(jìn)行。
4. DNA自身環(huán)化的連接：
參考步驟1e，待插入片段換成適量的水即可。其余步驟按照步驟1f-1h進(jìn)行。
5. 其它類型的DNA片段連接參考上述方法進(jìn)行。

常見問(wèn)題： 
1. 連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化效率很低或陽(yáng)性克隆非常少：
a. 可能感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率太低，用質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)檢測(cè)感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率。
b. 可以嘗試提高載體或插入片段的純度。對(duì)于平端連接需注意適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間。 
c. 可能載體酶切不夠充分，用未經(jīng)連接的載體轉(zhuǎn)化作為陰性對(duì)照。 
d. 用存放DNA的溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，作為陰性對(duì)照，檢測(cè)感受態(tài)細(xì)菌是否存在問(wèn)題。