快速DNA連接試劑盒

快速DNA連接試劑盒(Rapid DNA Ligation Kit) 是信裕生物研發(fā)的一種把DNA片段在短至5-10分鐘內(nèi)快速插入到載體(vector)中的連接試劑盒。對(duì)于雙粘端DNA片段的插入僅需5-10分鐘即可完成，對(duì)于雙平端DNA片段的插入僅需15分鐘即可完成。同時(shí)本試劑盒也可以用于其它各種常規(guī)的雙鏈DNA連接反應(yīng)。連接30分鐘即可達(dá)到效果，與連接過(guò)夜的效果一致。
本試劑盒可以用于PCR片段和載體的連接、酶切產(chǎn)物和載體的連接、linker和載體的連接、linker和linker的連接等各種雙鏈DNA的連接。
為了獲得快速高效的連接效果，本試劑盒采用了一種特殊的高活力Rapid T4 DNA Ligase以及相應(yīng)的快速連接緩沖液，確保在短時(shí)間內(nèi)可以獲得很好的連接效果。連接30分鐘和連接過(guò)夜的效果相當(dāng)，通常只須連接5-10分鐘即可滿足常規(guī)用途(圖1)。

圖1.快速DNA連接試劑盒實(shí)測(cè)效果圖。雙酶切后的載體室溫自連30min(A)或16℃自連過(guò)夜(D)作為陰性對(duì)照；雙酶切后的載體與待插入片段室溫連接10min(B)、30min(C)或者16℃連接過(guò)夜(E)，隨后轉(zhuǎn)化細(xì)菌涂板，并于第二天取平板觀察拍照。
在確保連接效果的同時(shí)，確保完成連接后不必進(jìn)行任何純化即可直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌。另外，快速連接緩沖液中已經(jīng)含有ATP、鎂離子等各種必需物質(zhì)，無(wú)需再添加其它任何試劑。
本試劑盒用于總體積為10μl的連接體系時(shí)可以進(jìn)行100個(gè)連接反應(yīng)，用于總體積為20μl的連接體系時(shí)可以進(jìn)行50個(gè)連接反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
連接反應(yīng)完成后即可直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌，請(qǐng)勿采用加熱方法失活Rapid T4 DNA ligase。加熱處理會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的轉(zhuǎn)化效率顯著下降。
對(duì)于載體單酶切插入外源片段的情況，需注意對(duì)載體進(jìn)行脫磷處理，以避免質(zhì)粒自連。
快速連接緩沖液(2X)使用前一定要完全溶解并混勻，加入到連接體系后也須注意混勻。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
 

使用說(shuō)明：
1. PCR產(chǎn)物或酶切片段和普通載體的連接：
a. 取1-2μg載體酶切過(guò)夜，或至少酶切3-5小時(shí)以上。盡量確保酶切充分，否則后續(xù)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生很多自連的克隆。
b. 載體酶切完畢后，可以使用試劑盒進(jìn)行純化，例如信裕生物的PCR純化試劑盒/DNA純化試劑盒(D0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。對(duì)于酶切產(chǎn)生較大片段(大于50-60bp)的情況推薦采用切膠回收的方式。
c. 對(duì)于PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的DNA片段。凝膠中DNA片段的回收可以使用試劑盒進(jìn)行操作，例如信裕生物的DNA凝膠回收試劑盒(D0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收DNA片段。
d. 對(duì)于回收的PCR產(chǎn)物或其它需酶切的質(zhì)?；駾NA片段，用適當(dāng)內(nèi)切酶酶切，隨后純化酶切產(chǎn)物。
注：這一步的酶切不必酶切特別充分，通常酶切效率能達(dá)到80-90%以上即可。即本步驟的酶切通常酶切1-2小時(shí)即可。酶切產(chǎn)物可以使用試劑盒進(jìn)行純化，例如信裕生物的PCR純化試劑盒/DNA純化試劑盒(D0033)。也可以采用常規(guī)的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法純化載體。
e. 取約25-100ng經(jīng)過(guò)酶切和純化的載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體系。
注：很多時(shí)候由于載體量和待插入片段的量都比較少，在回收后很難定量。此時(shí)可以根據(jù)回收前電泳條帶的亮度進(jìn)行大致的估計(jì)。通常以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的某一條帶為參考，估計(jì)或通過(guò)灰度半定量您的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計(jì)的純化或凝膠回收時(shí)的得率計(jì)算出最終得到的載體量和待插入片段量的比例關(guān)系。

f. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
g. 室溫(25℃)孵育連接5-10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)于雙平端連接需室溫(25℃)孵育15-30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
注1：對(duì)于雙粘端連接：室溫孵育5-10分鐘通?？梢赃_(dá)到孵育更長(zhǎng)時(shí)間所能達(dá)到連接效率的70%以上。室溫孵育30分鐘和16℃孵育過(guò)夜相比，無(wú)顯著差異。連接5-10分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒(méi)有準(zhǔn)備好，完全可以適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間。但通常不宜超過(guò)60分鐘。如果可能超過(guò)60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長(zhǎng)時(shí)間甚至過(guò)夜。
注2：對(duì)于雙平端連接：室溫孵育15分鐘通?？梢赃_(dá)到孵育更長(zhǎng)時(shí)間所能達(dá)到連接效率的70%以上。室溫孵育60分鐘和16℃孵育過(guò)夜相比，無(wú)顯著差異。連接15分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒(méi)有準(zhǔn)備好，完全可以適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間。但通常不宜超過(guò)60分鐘。如果可能超過(guò)60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長(zhǎng)時(shí)間甚至過(guò)夜。
注3：上述室溫連接效率的數(shù)據(jù)在25℃時(shí)獲得，在20-27℃時(shí)獲得的連接效率比較接近。室溫較低或較高時(shí)推薦在25℃水浴進(jìn)行連接。
h. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。
2. PCR產(chǎn)物和T載體的連接：
a. PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，切膠回收預(yù)期大小的DNA片段。凝膠中DNA片段的回收可以使用試劑盒進(jìn)行操作，例如信裕生物的DNA凝膠回收試劑盒(D0056)。也可以采用反復(fù)凍融等方法回收DNA片段。
b. 按照T載體的說(shuō)明書(shū)取適量T載體，加入3倍摩爾數(shù)的待插入片段。參考下表設(shè)置連接反應(yīng)體系。
注：很多時(shí)候由于載體量和PCR產(chǎn)物的量都比較少，在回收后很難定量。此時(shí)可以根據(jù)回收前電泳條帶的亮度進(jìn)行大致的估計(jì)。通常以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的某一條帶為參考，估計(jì)或通過(guò)灰度半定量您的目的條帶和該參考條帶的亮度的比例關(guān)系。然后再按照預(yù)計(jì)的純化或凝膠回收時(shí)的得率計(jì)算出最終得到的載體量和PCR產(chǎn)物的量的比例關(guān)系。

c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d. 室溫孵育5-10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。
注：室溫孵育5-10分鐘通常可以達(dá)到孵育更長(zhǎng)時(shí)間所能達(dá)到連接效率的70%以上。室溫孵育30分鐘和16℃孵育過(guò)夜相比，無(wú)顯著差異。連接5-10分鐘后，如果轉(zhuǎn)化等后續(xù)步驟還沒(méi)有準(zhǔn)備好，完全可以適當(dāng)延長(zhǎng)室溫的連接時(shí)間。但通常不宜超過(guò)60分鐘。如果可能超過(guò)60分鐘，可以在4℃或16℃放置較長(zhǎng)時(shí)間甚至過(guò)夜。
e. 隨后即可直接取連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。
3. Linker或RNAi片段和載體的連接：
a. 載體的酶切和純化同步驟1a和1b。
b. Linker或RNAi片段的退火可以選擇適當(dāng)?shù)腄NA退火緩沖液，例如信裕生物的Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)(D0251)， 進(jìn)行退火反應(yīng)。
c. 長(zhǎng)度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段，可以按照5:1至10:1的比例和載體進(jìn)行連接反應(yīng)。例如載體為0.03pmol，則插入片段可以為0.15至0.3pmol。長(zhǎng)度小于8bp的linker，比例需調(diào)整為10:1以上。
d. 除插入片段的用量外，隨后按照步驟1e-1h進(jìn)行。
4. DNA自身環(huán)化的連接：
參考步驟1e，待插入片段換成適量的水即可。其余步驟按照步驟1f-1h進(jìn)行。
5. 其它類型的DNA片段連接參考上述方法進(jìn)行。

常見(jiàn)問(wèn)題： 
1. 連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化效率很低或陽(yáng)性克隆非常少。
a. 可能在加入快速連接緩沖液(2X)后沒(méi)有充分混勻。
b. 可能感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率太低，用質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)檢測(cè)感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率。
c. 可以嘗試提高載體或插入片段的純度。對(duì)于平端連接需注意適當(dāng)延長(zhǎng)連接時(shí)間。
d. 可能載體酶切不夠充分，用未經(jīng)連接的載體轉(zhuǎn)化作為陰性對(duì)照。
e. 用存放DNA的溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，作為陰性對(duì)照，檢測(cè)感受態(tài)細(xì)菌是否存在問(wèn)題。