單酶一管式RT-PCR試劑盒（Tth）

英文名稱：
運(yùn)輸：低溫
保存：負(fù)20℃
有效期：1年
貨期：1-2天
其他：
產(chǎn)品介紹：
逆轉(zhuǎn)錄和RT由一個(gè)酶完成

使用方法

1. 將 50-300mg 昆蟲(chóng)組織放入 10-15 mL 塑料離心管中，加入 1 mL 溶液 A，然后用勻漿器勻漿 5-20 秒。勻漿時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎昆蟲(chóng)組織，硯磨完后加入 1 mL 溶液 A。注意：溶解溶液 A 沉淀。溶液 A 在 4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前必須放在 65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用。

2. 將勻漿物或硯磨物轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離心管中(可以不必轉(zhuǎn)移非液體的細(xì)胞碎片)。

3. 在離心管中加入 0.3 mL 的溶液 B 和 0.2 mL 自備氯仿，在振蕩器上振蕩30 秒混勻，此時(shí)溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時(shí)必須使管底溶液震蕩起來(lái)。

4. 室溫 12,000 rmp 離心 3-5 分鐘，兩相間將有約 5-10 毫米厚的細(xì)胞破碎物。

5. 將上清液(約 0.6 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，下層有機(jī)相和中間層含有 DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，避免觸及或吸取。好留下 100 uL上清液不取。

6. 加入等體積的溶液 C，充分顛倒混勻。

7. 將一半的溶液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rmp 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

8. 將剩下的一半溶液轉(zhuǎn)移到同一離心吸附柱中， 12,000 rmp 室溫離心半分鐘，棄穿透液。

9. 加 0.7 mL 通用洗柱液，室溫 12,000 rmp 離心半分鐘，棄穿透液。

10. 加 0.3 mL 通用洗柱液，室溫 12,000 rmp 離心半分鐘，棄穿透液。此步可以省略。

11. 室溫 12,000 rmp 離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)影響 RNA的使用。

12. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到 RNase-free 收集管中，加入 50-100 uL RNA 洗脫液，室溫放置 1-2 分鐘。

13. 12,000 rmp 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的電泳檢測(cè)：如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。注意：大部分昆蟲(chóng)的 28S RNA 被切割成兩個(gè)小的片段，彼此用氫鍵相連，所以在甲醛變性膠中，沒(méi)有 28S帶出現(xiàn)（文獻(xiàn)見(jiàn)：Eva C. Winnebeck，Craig D. Millar and Guy R. Warman，Why does insect RNA look degraded Journal of InsectScience: Vol. 10：1-7）

15. RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測(cè)定：將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測(cè)其在 OD260 的光吸收。通過(guò)光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/組織用量)。

16. RNA 純度測(cè)定：無(wú)污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。