兩管式RT-PCR試劑盒（AMV-Taq）

產(chǎn)品及特點(diǎn)本產(chǎn)品使用重組禽類(lèi)成髓纖維病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, AMV RT)，從總 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成一鏈 cDNA 的試劑盒， 含有 cDNA 一鏈合成所需的所有試劑。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的 活性，能夠作用于 GC 含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 RNA。合成的一鏈 cDNA 可廣泛應(yīng)用于 第二鏈合成、雜交、PCR 擴(kuò)增、Real-time PCR 反應(yīng)等。

1. 即開(kāi)即用，足夠 50 次 RT 反應(yīng)（20μL 體系）和 600 次 PCR 反應(yīng)（30μL 體系）。

2. cDNA 一鏈合成試劑盒可靈活選用隨機(jī)引物、Oligo dT 引物或基因?qū)Ｒ灰?，適合 各種情況。

3. 兩管式操作，RT 和 PCR 在不同試管中進(jìn)行，便于單獨(dú)優(yōu)化 RT 反應(yīng)或 PCR 反應(yīng)條件。

4. 全長(zhǎng)的一鏈 cDNA 產(chǎn)量高，最長(zhǎng)可合成 8 kb 的 cDNA。
規(guī)格及成分 成 分 編 號(hào) 十孔盒包裝
AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) 130921a 50 μL
AMV RT Buffer（含 dNTP） 130921b 300 μL
Oligo (dT)18引物(0.5 μg/μL) 100814 50 μL
隨機(jī)引物(0.5 μg/μL) 100409 50 μL
PCR MagicMix 3.0，含染料 90805 9 mL
RNase-free 水 80403 5 mL
使用手冊(cè) 130921sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 樣品 RNA、模板專(zhuān)一正向和反向引物。

使用方法 一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）

1. 可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應(yīng)商的產(chǎn)品，但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超純水中。

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

2. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 μL 體系）:

RNA 模板

總 RNA < 5 μg

或 poly(A) mRNA

或隨機(jī)引物(0.5 μg/μL) 1 μL

或自備模板專(zhuān)一反向引物(20 pmol/μL) 1-2 μL

RNase-free 水 補(bǔ)水到 13 μL

注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染。隨機(jī)引物與 RNA 模板的比例將決定cDNA 合成的平均長(zhǎng)度（成反比）。一般情況下隨機(jī)引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想轉(zhuǎn)錄總 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），則可優(yōu)先選用 OligodT 引物，這樣就可以排除非 mRNA 的干擾。

3. 輕輕混勻后離心 3-5 sec，反應(yīng)混合物在 65℃溫浴 5 min 后冰浴 30 sec，離心 3-5 sec。

將試管冰浴，再加入如下組分：

AMV RT Buffer（含 dNTP） 6 μL

AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI） 1 μL

輕輕混勻后離心 3-5 sec。

在 PCR 儀上按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

cDNA 合成 42℃ 30-60 min；

終止反應(yīng) 85℃ 5 min（酶失活），處理后，置于冰上放置。

注意：若使用 Oligo dT 引物或序列特異性引物，進(jìn)行 42℃，30-60 min 反應(yīng)； 若

使用隨機(jī)引物，應(yīng)先進(jìn)行 25℃，10min 反應(yīng)，然后進(jìn)行 42℃，30-60 min 反應(yīng)。

三、PCR（30 μL 體系）

4. 在 PCR 管中加入下列成分：

成分 加入量

PCR MagicMix 3.0，含染料 15 μL

cDNA 樣品（上步的 RT 反應(yīng)液） 1-5 μL

模板專(zhuān)一性正向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL

模板專(zhuān)一性反向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL

補(bǔ)水到 30 μL

注意：cDNA 也可以稀釋后作 PCR 模板。是否稀釋或稀釋倍數(shù)取決于靶基因的豐度。

5. PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物決定，下面的只做參考)：

過(guò)程 溫度 時(shí)間

預(yù)變性 94℃ 5 min

PCR 反應(yīng)

（35 個(gè)循環(huán)）

94℃ 1 min

55℃ 1 min

20191012ww

72℃ 2 min

后延伸 72℃ 10 min

四、電泳檢測(cè)

取 5-10μL PCR 產(chǎn)物直接在 PAGE 或瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要額外再加電泳上樣液。