兩步法熒光定量RT-PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點本試劑盒是整合 cDNA 一鏈合成試劑（RT 試劑盒）和即用型 qPCR 試劑而得的 qRT-PCR 試劑盒。cDNA 一鏈合成反應(yīng)和 qPCR 反應(yīng)分別在兩個離心管中進行。本試 劑盒具有下列特點：

1. 即開即用，足夠 50 次 RT 反應(yīng)（10uL 體系）和 50 次 qPCR 反應(yīng)（20 uL 體系）。

2. RT 和 PCR 分開進行，方便優(yōu)化 RT 和 qPCR 條件，也方便一個 RT 反應(yīng)用于多個不 同引物的 qPCR 擴增。

3. RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分，簡化了反應(yīng)設(shè)置步驟。

4. qPCR mix 是 2×預配液，也簡化了反應(yīng)設(shè)置步驟。

5. qPCR mix 含 qPCR 染料，無需另外加入相關(guān)熒光 PCR 染料。

6. 擴增效率高, 最長可擴增 5 Kbp 以上的 RNA。

7. 提供定量 PCR 專用模板稀釋液，保證在制作標準曲線時低濃度樣品的準確性。
規(guī)格及成分 成 分 編 號 十孔盒包裝
2×RT Mix 60906a 40 uL（黃蓋）
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) 60906b 10 uL（紅蓋）
2×qPCR MagicMix 90805 1 mL（棕色管）
定量 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL（綠蓋）
RNase-free 水 80403 1 mL（藍蓋）
使用手冊 101219sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸,-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 樣品 RNA、PCR 引物、ROX 染料 使用方法

一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）

1、可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應(yīng)商的產(chǎn)品，但 得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超純水中。

2、如果需要用 RNA 制備標準曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板稀釋液將 RNA 樣品 稀釋不同梯度，并分別作為下步 RT 反應(yīng)的模板。

3、由于污染的 gDNA 會嚴重影響 RNA 的定量，因必須徹底去除 RNA 樣品中的 gDNA 污 染。用戶可以另購 RNase-free DNase 來消化 RNA 樣品，也可以合成只識別外顯子的 引物。 

二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反應(yīng)體系（10 uL 體系），在每個管中加入下列成分: 成分 加入量 總 RNA 100-500 ng 2×RT mix 4 uL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1 uL RNase-free 水 補到 10 uL

5、42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。

6、85℃保溫 5 秒以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作為下步 qPCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在 -20℃長期保存。如果需要用 cDNA 制備標準曲線，則需在此步用定量 PCR 專用模板 稀釋液將 cDNA 樣品稀釋不同梯度，并分別作為下步 qPCR 反應(yīng)的模板。

三、qPCR（20 uL 體系）

8、在每個 PCR 管中加入下列成分： 成分 加入量 qPCR MagicMix 10 uL cDNA 樣品（來于上步的 RT 反應(yīng)） 2 uL PCR 正向引物(10 pmol/uL) 1 uL PCR 反向引物(10 pmol/uL) 1 uL 自備 ROX 染料 I 或 II（見注） 2 uL RNase-free 水 4 uL

注意：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三種型號的熒光 PCR 儀器，則需 用自備的 ROX 進行 Ct 值校正。對 ABI 7700 和 7900，ROX 的佳濃度為 1×（即 在每 20 uL 反應(yīng)體系中加 2 uL 10×ROX）。對 ABI 7500， ROX 的佳濃度為 0.05-0.1×（每 20 uL 反應(yīng)體系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可將 10×ROX 稀釋到 1×，然后每個反應(yīng)體系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 會在溶解曲線中產(chǎn)生噪音，因 此，如果出現(xiàn)了雜峰，將軟件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”選項取消打 勾，然后重新分析數(shù)據(jù)。 對于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000， RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型號的熒光 PCR 儀器，ROX 不是必須的， 但加入的話也不會影響整個 PCR 分析。 

9、PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要用戶根據(jù)模板和引物決定，下面參數(shù)的只做參考)： 過程 溫度 時間 預變性 94℃ 5 min PCR 反應(yīng) （40 個循環(huán)） 94℃ 1 min 55℃ 1 min 72℃ 2 min 后延伸 72℃ 10 min

10、 實驗結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和溶解曲線，制作標準曲線。具體方法 隨儀器不同而不同，請參考 qPCR 儀器手冊。