谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）試劑盒說明書

                                 
                                                         分光光度法  50管/48樣

注    意： 正式測定前務(wù)必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：                           

GDH（EC 1.4.1.2）廣泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同參與谷氨酸的合成，在氨同化和轉(zhuǎn)化成有機氮化合物的代謝中起重要作用。

谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）試劑盒測定原理：

GDH催化NH₄⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通過測定340nm吸光度的下降速率，計算GDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）樣品：直接檢測。

谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）試劑盒測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測定

（1）在試劑二中加入25mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后12h內(nèi)用完）；

（2）取0.05mL樣本和0.95mL工作液于1mL比色皿中，混勻，加工作液的同時開始計時，在340 nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1和5分20秒時的吸光度A2，計算ΔA=A1-A2。

GDH活性計算：

1、血清（漿）中GDH活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2、組織、細菌或細胞中GDH活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=1.286×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。