谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒說明書
分光光度法 50管/24樣
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不僅可以防止過多的銨離子對生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要儲存和運輸形式。
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒測定原理
GS在ATP和Mg2+存在下，催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺進一步轉(zhuǎn)化為γ─谷氨?；惲u肟酸，在酸性條件下形成的絡(luò)合物在540nm處有吸收峰，可用分光光度計測定。
所需的儀器和用品
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑二：12mL×1瓶，-20℃保存，臨用前37℃預(yù)熱20min，充分混勻，如有沉淀，靜置10min，取上清待用。
試劑三：粉劑×2瓶，-20℃保存。用時每瓶加入5mL蒸餾水充分溶解待用。
試劑四：15mL×1瓶，4℃保存。
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒樣本測定的準備
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中加入下列試劑：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
試劑一 | 400 |
|
試劑二 |
| 400 |
試劑三 | 175 | 175 |
樣本 | 175 | 175 |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）準確水浴30min
混勻，25℃室溫靜置10min后，5000g，25℃離心10min，取上清液測定540nm處的吸光值A。△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。
谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）試劑盒GS活力單位的計算
標準曲線：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999
1、血清（漿）GS活性
單位定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
計算公式：
GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷V樣÷T
=10.268×ΔA
2、組織、細菌或細胞GS活性
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
=10.268×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/g 鮮重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=10.268×ΔA÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
單位定義：每1萬個細菌或細胞在每mL反應(yīng)體系中每小時產(chǎn)生1μmol γ-谷氨?；惲u肟酸定義為一個酶活力單位。
GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷T
=0.021×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，0.75mL； V樣：加入樣本體積，0.175mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。
關(guān)鍵字： 谷氨酰胺合成酶（Glutamine sy;谷氨酰胺合成酶（Glutamine sy;
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