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上海阿拉丁生化科技股份有限公司

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【阿拉丁】熒光標(biāo)記抗體的蛋白質(zhì)印跡法
發(fā)布日期:2024/11/18 14:03:02發(fā)布人:上海阿拉丁生化科技股份有限公司

熒光標(biāo)記抗體的蛋白質(zhì)印跡法

 

 

        對(duì)于蛋白質(zhì)印跡,將膜與稀釋在含有5% w/v BSA或脫脂奶粉的1×TBST(0.1% Tween®20)中的一抗在振蕩器上于4°C下孵育過夜。請(qǐng)參閱一抗產(chǎn)品網(wǎng)頁了解推薦的一抗稀釋緩沖液和抗體稀釋度。

 

        雙色蛋白質(zhì)印跡需要來自不同物種的一抗和用不同染料標(biāo)記的二抗。表位重疊可能會(huì)造成干擾,在雙色蛋白質(zhì)印跡中應(yīng)予以考慮。如果一抗需要不同的一抗孵育緩沖液,則在兩種緩沖液中測(cè)試每種一抗,以確定最適合雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的緩沖液。

 

所需溶液和試劑

 

        - 20×磷酸鹽緩沖液(PBS)1 L:將50 ml 20×PBS 加入 950 ml dH2O 中并混合。

        - 10×Tris緩沖鹽水(TBS)1 L:將100 ml 10×TBS 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 1×SDS上樣緩沖液:藍(lán)色上樣包或紅色上樣包;將1/10體積的30×二硫蘇糖醇(DTT)加入1 體積的3×SDS上樣緩沖液中,配制新鮮的3×還原性上樣緩沖液。用dH2O稀釋至1×。

        - 10×Tris-Glycine SDS電泳緩沖液1 L:將100 ml 10×電泳緩沖液加入900 ml dH2O中并混合。

        - 10×Tris-Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液1 L:將100 ml 10×轉(zhuǎn)移緩沖液添加到200 ml甲醇+ 700 ml dH2O中并混合。

        -10×Tris緩沖鹽水(含Tween®20)(TBST-10×)1 L:將100 ml 10×TBST 加入900 ml dH2O 中并混合。

        - 脫脂奶粉

        - 封閉緩沖液:1×TBS加5% w/v 脫脂奶粉;若要制備150 ml,則將7.5 g脫脂奶粉加入150 ml 1×TBS 中并充分混合。不應(yīng)將Tween® 20 添加到封閉緩沖液中,因?yàn)樗哂凶园l(fā)熒光,并且會(huì)增加非特異性背景。封閉步驟后,將Tween®20添加到后續(xù)稀釋緩沖液中。

        - 洗滌緩沖液:1×TBST。

        - 牛血清白蛋白(BSA),如B265993。

        - 一抗稀釋緩沖液:1×TBST,含 5% BSA或5%脫脂奶粉,如一抗數(shù)據(jù)表所示;若要配制20 ml,則將1.0 g BSA或脫脂奶粉加入20 ml 1×TBST 中并混勻。

        - 二抗稀釋緩沖液:1×TBST加5%脫脂奶粉;將1.0 g脫脂奶粉加入20 ml 1×TBST中并充分混合。(二抗;抗兔Ab181958 和 Ab176447;抗鼠 Ab181952 和 Ab179006)。

        - 預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn),范圍廣(10 - 180 kDa),例如M665706。

        - 對(duì)于印跡膜和紙,通常建議孔徑為0.2 µm。

        注意:建議使用反滲透去離子(RODI)水或同等級(jí)別的水來配制溶液。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1. 樣品制備

 

1)從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基并用預(yù)冷的1×PBS清洗細(xì)胞。

 

2)除去 PBS,加入 1×SDS 樣品緩沖液(6 孔板每孔 100 µl或10 cm 直徑板每板 500 µl)以裂解細(xì)胞。立即從板上刮下細(xì)胞,將提取物轉(zhuǎn)移到微量離心管中,放在冰上。

 

3)超聲波處理10 - 15秒。

 

4)取每個(gè)樣品20 µl,在95 - 100 ℃下加熱5分鐘,然后在冰上冷卻。

 

        注意:具體上樣量可根據(jù)蛋白濃度及實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整,為避免蒸發(fā)、粘壁等造成體積損失,需制備適量樣品。

 

5)放入微量離心機(jī)離心5分鐘。

 

2. 上樣及電泳

 

1)組裝預(yù)先配置好的SDS-PAGE凝膠(10 cm×10 cm),并加入電泳緩沖液。

 

2)將20 µl上樣到SDS-PAGE凝膠(10 cm×10 cm)上。

 

        注意:具體上樣量可根據(jù)蛋白濃度和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行調(diào)整。

        建議加入預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品(M665706,10 µl/lane)來驗(yàn)證蛋白轉(zhuǎn)移并測(cè)定分子量。

 

3)根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量設(shè)置電壓和電泳時(shí)間,開始跑膠。

 

3. 轉(zhuǎn)膜

 

        按正確的順序組裝凝膠和轉(zhuǎn)印裝置,設(shè)定電壓和轉(zhuǎn)印時(shí)間,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。有關(guān)詳細(xì)的轉(zhuǎn)移程序,請(qǐng)參閱《蛋白質(zhì)印跡的通用實(shí)驗(yàn)方案》。

 

4. 膜阻斷和抗體孵育

 

        注:容量適用于10 cm×10 cm(100 cm2)的膜;對(duì)于不同尺寸的膜,容量相應(yīng)調(diào)整。

 

1)(可選)轉(zhuǎn)移后,室溫下用25 ml TBS清洗硝酸纖維素膜5分鐘。

 

2)將膜放入25 ml封閉緩沖液中,室溫下孵育1小時(shí)。

 

        注意:請(qǐng)勿將 Tween®20添加到封閉緩沖液中。

 

3)用15 ml TBST洗滌三次,每次5分鐘。

 

4)取10 ml封閉緩沖液加入一抗(按產(chǎn)品說明書建議稀釋度),配制一抗稀釋液,將膜放入一抗稀釋緩沖液中,在振蕩器上4°C孵育過夜。

 

5)用15 ml TBST洗滌三次,每次5分鐘。

 

6)將膜放入 10 ml熒光素偶聯(lián)的二抗稀釋液(如Ab181958、 Ab176447、 Ab181952 和 Ab179006)(1 mg/ml 原液,稀釋度為 1:5000-1:25,000)中,并在振蕩器上室溫孵育1小時(shí)。

 

7)用15 ml TBST洗滌三次,每次5分鐘。

 

5. 蛋白質(zhì)檢測(cè)

 

1)瀝干膜上多余的TBST,并使其干燥。

 

        注意:對(duì)于熒光染色,確保膜干燥非常重要。

 

2)使用合適的熒光掃描儀并按照制造商的建議掃描膜。

 

如需了解更多產(chǎn)品詳情,請(qǐng)前往阿拉丁官網(wǎng)查詢。

https://www.aladdin-e.com


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