蛋白質(zhì)去磷酸化實驗方案
蛋白質(zhì)去磷酸化是細胞內(nèi)一個重要的生化過程，涉及從蛋白質(zhì)上的特定氨基酸殘基上去除磷酸基團。該過程與蛋白質(zhì)磷酸化相對應，兩者共同形成對細胞信號轉(zhuǎn)導至關重要的動態(tài)平衡。蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化作為一對可逆的生化反應，通過“分子開關”的方式，精細調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構、功能以及細胞內(nèi)的多種生理活動。
蛋白質(zhì)去磷酸化的主要功能是由一類稱為蛋白質(zhì)磷酸酶的酶類催化完成的，這些酶能夠水解磷酸酯鍵，即絲氨酸、蘇氨酸以及酪氨酸位點的去磷酸化。這一過程對于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、穩(wěn)定性、亞細胞定位以及與其他分子的相互作用至關重要。
蛋白質(zhì)去磷酸化的紊亂與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括糖尿病、肥胖、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病以及自身免疫性疾病等，因此蛋白質(zhì)磷酸酶也成為了潛在的藥物發(fā)現(xiàn)靶標。在生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)中，理解和調(diào)控蛋白質(zhì)去磷酸化過程對于揭示疾病機制和開發(fā)治療策略具有重要意義。
為了證明抗體對磷酸化狀態(tài)的蛋白質(zhì)的特異性，可以在SDS-PAGE之前或轉(zhuǎn)移到膜之后對蛋白質(zhì)進行去磷酸化。與未處理的樣品相比，去磷酸化的樣品應幾乎不染色或不染色。
所需材料
- 小牛腸堿性磷酸酶（CIP）
- CIP緩沖液：100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM二硫蘇糖醇，25ºC時pH值調(diào)節(jié)至7.9
- 蛋白酶抑制劑混合物，不含EDTA
實驗步驟
1.先用裂解緩沖液中裂解細胞或均質(zhì)化組織，然后測定蛋白質(zhì)濃度，留出兩份裂解物/均質(zhì)化組織樣本。一份用于去磷酸化，一條用于對照（未處理的樣品）。
注意：一般建議每條泳道的粗提取物含有20-30 µg的蛋白質(zhì)。
避免在裂解緩沖液中使用正釩酸鈉（RIPA 裂解緩沖液的一種成分）和 EDTA：10 mM正釩酸鈉可抑制CIP（10單位）90%的活性，而50 mM EDTA可使CIP活性（10單位）幾乎100%失活。
如果使用粗提取物，則必須在CIP緩沖液中加入蛋白酶抑制劑。
2.將蛋白質(zhì)/裂解物重懸于CIP緩沖液中，每1 µL 1× 緩沖液含1 µg蛋白質(zhì)，含蛋白酶抑制劑，不含EDTA。
3.向“+磷酸酶”處理的樣品中添加CIP酶，每µg蛋白質(zhì)添加1單位CIP。在37°C下最多孵育60分鐘，如果擔心蛋白水解降解，可以適當縮短孵育時間，或者放到較低溫度下進行孵育。
4.此時可以將樣品冷凍并保存，或按照SDS-PAGE的常規(guī)方式進行后續(xù)操作。
注意：如果有需要的話，可以添加磷酸鈉（pH 7.4）作為競爭性抑制劑，最終濃度為10 mM。
對于僅在蛋白質(zhì)變性時結(jié)合其磷酸化蛋白靶標的抗體，轉(zhuǎn)膜后用磷酸酶處理膜可能比在SDS-PAGE前用磷酸酶處理未變性的裂解物更好。為了進行良好的控制比較，用磷酸酶處理的膜應該是從包含一個或多個重復泳道的單個凝膠印跡中切下的一塊。
實驗步驟
1.將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF上，并用含有0.1% Triton X-100和5% BSA的TBS溶液在室溫下封閉膜1小時。
注意，這里不建議用牛奶替代BSA，牛奶中含有酪蛋白，一種磷酸化蛋白，如果抗體與磷酸化位點發(fā)生交叉反應，則可能產(chǎn)生背景染色。
2.在轉(zhuǎn)膜完成后，使用標記筆或刀片在膜上劃線，確保每個樣本和其重復樣本都被包含在不同的膜片段中。
3.然后沿著劃線切割膜，使得每個片段都至少包含一個樣本及其對應的重復樣本。一個片段上可用于進行去磷酸化處理，而另一個片段可用于常規(guī)檢測，從而比較處理前后的差異。
4 .將兩片分別放入裝有CIP緩沖液的容器中，每個容器3-5 mL。
5.往溶液中添加CIP，進行去磷酸化處理。
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