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【阿拉丁】Boc樹(shù)脂裂解方案
發(fā)布日期:2024/9/13 14:25:52發(fā)布人:上海阿拉丁生化科技股份有限公司

Boc樹(shù)脂裂解方案

 

 

        在肽合成過(guò)程中,Boc保護(hù)基團(tuán)被廣泛用于保護(hù)氨基酸的氨基末端,以防止在合成過(guò)程中發(fā)生不必要的反應(yīng)。在肽合成完成后,通過(guò)裂解和去保護(hù)步驟將肽從樹(shù)脂上釋放,并去除這些保護(hù)基團(tuán),以獲得目標(biāo)肽序列。選擇適當(dāng)?shù)牧呀夥椒▽?duì)確保高純度的肽產(chǎn)物至關(guān)重要。本文將詳細(xì)介紹幾種常用的Boc樹(shù)脂裂解方法,并討論裂解前的準(zhǔn)備工作、實(shí)驗(yàn)步驟及相關(guān)注意事項(xiàng)。

 

Boc樹(shù)脂裂解的主要方法

        1. 使用無(wú)水氟化氫(HF)裂解

        無(wú)水氟化氫(HF)是最為常用的Boc樹(shù)脂裂解劑。它能夠高效地裂解Boc樹(shù)脂,并全面去除肽中的保護(hù)基團(tuán),是許多合成實(shí)驗(yàn)室的首選裂解劑。盡管HF具有高毒性和強(qiáng)腐蝕性,其高效性仍使其在裂解過(guò)程中的應(yīng)用非常廣泛。

 

         實(shí)驗(yàn)步驟:

         1. 準(zhǔn)備工作:在進(jìn)行HF裂解之前,確保肽樹(shù)脂已完全干燥。將肽樹(shù)脂置于專門設(shè)計(jì)的HF裂解裝置中,并在20℃下通過(guò)氮?dú)馓畛溲b置,以確保無(wú)水環(huán)境。

         2. 加入清除劑:為了保護(hù)肽鏈中可能敏感的氨基酸殘基(如色氨酸),加入適量的清除劑,如蒽酚吲哚二甲硫醚。這些清除劑能夠與潛在的自由基反應(yīng),從而避免肽鏈的降解。

         3. HF裂解:將裂解裝置冷卻至0℃,然后緩慢加入約10毫升無(wú)水HF。輕輕攪拌5分鐘以確保清除劑與HF充分混合,繼續(xù)緩慢加入HF至所需體積(通常為50-100 mL),確保HF完全覆蓋肽樹(shù)脂。將裝置維持在0℃,并攪拌30分鐘到1小時(shí)。

         4. HF氣體釋放與清洗:反應(yīng)完成后,通過(guò)冷卻裝置緩慢釋放HF氣體,并使用氮?dú)夥磸?fù)沖洗裝置三次以確保HF完全排出。

         5. 肽回收:打開(kāi)裂解裝置,將肽樹(shù)脂懸浮在冷的無(wú)水乙醚中,然后離心分離,棄去上清液。

         6. 樹(shù)脂洗滌與干燥:用乙醚重復(fù)洗滌樹(shù)脂兩次,然后將樹(shù)脂置于高真空下干燥,最終獲得裂解后的肽產(chǎn)物。

 

         注意事項(xiàng):

         • HF具有極強(qiáng)腐蝕性和毒性,因此操作必須在專門設(shè)計(jì)的防護(hù)設(shè)備內(nèi)進(jìn)行,且實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備良好的通風(fēng)設(shè)施。

         • 實(shí)驗(yàn)人員需佩戴全套防護(hù)裝備,包括防護(hù)眼鏡、面罩、橡膠圍裙和手套,以防止HF接觸皮膚或被吸入。

 

         2. 使用三氟甲磺酸(TFMSA)裂解

三氟甲磺酸(TFMSA)是一種相對(duì)溫和的裂解劑,常用于裂解對(duì)HF敏感的肽片段。雖然TFMSA的裂解能力略遜于HF,但它在處理某些特定肽片段時(shí)更為適合。

 

         實(shí)驗(yàn)步驟:

         1. 樹(shù)脂溶脹:將肽樹(shù)脂在二甲基亞砜(DMSO)中溶脹,通常需要溶脹30分鐘,以確保樹(shù)脂中的每個(gè)位點(diǎn)都能充分接觸到TFMSA。

         2. 裂解混合物的制備:在裂解容器中,加入TFMSA二甲基苯胺(作為酸清除劑),攪拌均勻,并將混合物冷卻至0℃。

         3. 加入肽樹(shù)脂:將已溶脹的肽樹(shù)脂加入冷卻至0℃的TFMSA混合物中,攪拌2小時(shí)以確保肽與裂解劑充分接觸。

         4. 樹(shù)脂分離與洗滌:反應(yīng)完成后,通過(guò)過(guò)濾分離樹(shù)脂,并依次用DMSO、二氯甲烷(DCM)甲醇(MeOH)洗滌樹(shù)脂,以去除殘留的TFMSA和肽碎片。

         5. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥至少4小時(shí),以獲得裂解后的純化肽產(chǎn)物。

 

         注意事項(xiàng):

         • TFMSA雖然比HF溫和,但仍具腐蝕性,操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

         • 使用的玻璃器皿和其他實(shí)驗(yàn)設(shè)備需耐酸,以避免TFMSA的腐蝕。

 

         3. 使用三甲基硅基三氟甲磺酸鹽(TMSOTf)裂解

         三甲基硅基三氟甲磺酸鹽(TMSOTf)是一種較為溫和的裂解試劑,特別適用于對(duì)HF敏感的肽片段。TMSOTf裂解的反應(yīng)性較弱,通常需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間和較高的溫度。

 

         實(shí)驗(yàn)步驟:

         1. 樹(shù)脂溶脹:將肽樹(shù)脂在二氯甲烷(DCM)中溶脹,通常溶脹時(shí)間為30分鐘,以確保樹(shù)脂顆粒均勻分散。

         2. 裂解混合物的制備:將裂解容器冷卻至0℃,然后緩慢加入TMSOTf,同時(shí)保持容器的溫度在0℃,并攪拌1小時(shí)。

         3. 加入肽樹(shù)脂:將溶脹后的肽樹(shù)脂加入冷卻至0℃的TMSOTf混合物中,反應(yīng)1小時(shí)。

         4. 樹(shù)脂分離與洗滌:反應(yīng)完成后,通過(guò)過(guò)濾分離樹(shù)脂,并依次用DCM、甲醇和乙醚洗滌樹(shù)脂,以去除裂解產(chǎn)物和殘留的TMSOTf。

         5. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥至少4小時(shí),獲得裂解后的肽產(chǎn)物。

 

         注意事項(xiàng):

         • TMSOTf的裂解效率較HF稍弱,但其溫和的裂解條件有助于減少副反應(yīng)的發(fā)生,特別適合處理對(duì)酸敏感的肽片段。

         • TMSOTf仍具有一定的腐蝕性,使用時(shí)應(yīng)小心處理。

 

         4. 使用其他裂解方法

         對(duì)于某些特定類型的樹(shù)脂,如肟樹(shù)脂(oxime resin),可采用不同于酸裂解的方法來(lái)生成肽腙和其他保護(hù)片段類似物。這些方法通常適用于合成對(duì)酸不穩(wěn)定的肽,或者需要特定保護(hù)基團(tuán)保持的肽段。

 

常用Boc兼容氨基酸衍生物的裂解兼容性

         在選擇裂解方法時(shí),了解各類Boc兼容的氨基酸衍生物在不同裂解條件下的穩(wěn)定性是非常重要的。以下是常用氨基酸在HF、TMSOTfTFMSA裂解中的兼容性。

 

氨基酸衍生物
HF兼容
TMSOTf兼容
TFMSA兼容
HBr兼容
Arg(NO2)
Asp(OBzl)
Cys(Acm)
Glu(OBzl)
His(Bom)
Lys(2-Cl-Z)
Ser(Bzl)
Thr(Bzl)
Trp(For)
Tyr(2-Br-Z)

 

樹(shù)脂裂解前的準(zhǔn)備工作

          在進(jìn)行裂解之前,肽樹(shù)脂的適當(dāng)準(zhǔn)備是防止副反應(yīng)和確保完全裂解及去保護(hù)的關(guān)鍵。裂解方法的選擇應(yīng)根據(jù)所使用的樹(shù)脂類型和肽序列中的氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)來(lái)決定。在開(kāi)始裂解之前,確保所用的樹(shù)脂和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)與選擇的裂解方法兼容。所有樹(shù)脂在裂解前都應(yīng)仔細(xì)清洗和干燥,以防止水分或殘留試劑的影響。

 

          1. 去除His的DNP保護(hù)基團(tuán)

          如果合成的肽中包含His(Dnp),必須在裂解之前去除DNP保護(hù)基團(tuán)。這是因?yàn)镈NP基團(tuán)的存在可能會(huì)影響后續(xù)裂解和去保護(hù)的效果。

 

          實(shí)驗(yàn)步驟:

          1. 樹(shù)脂溶脹:將肽樹(shù)脂在少量二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹,通常需要溶脹30分鐘,以確保樹(shù)脂中的每個(gè)位點(diǎn)都能充分接觸到去保護(hù)試劑。

          2. DNP去除反應(yīng):向溶脹樹(shù)脂中加入20倍摩爾過(guò)量的硫代苯酚,在室溫下攪拌1-2小時(shí),或放置過(guò)夜以確保DNP基團(tuán)完全去除。

          3. 樹(shù)脂分離與洗滌:反應(yīng)完成后,將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到燒結(jié)玻璃漏斗中,并依次用DMF、甲醇和乙醚洗滌樹(shù)脂。

          4. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥,最后進(jìn)行裂解操作。

 

          2. 去除N端Boc基團(tuán)

          在使用HF進(jìn)行裂解之前,通常需要先使用三氟乙酸(TFA)去除肽鏈N端的Boc基團(tuán)。這樣可以防止在HF裂解過(guò)程中形成t-丁基化副產(chǎn)物,并確保Boc氨基酸的完全去除。

 

          實(shí)驗(yàn)步驟:

          1. 樹(shù)脂溶脹:將肽樹(shù)脂在二氯甲烷(DCM)中溶脹,通常需要溶脹30分鐘,以確保樹(shù)脂的每個(gè)位點(diǎn)都能充分接觸到TFA。

          2. Boc基團(tuán)去除:將溶脹后的樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到燒結(jié)玻璃漏斗中,加入50% TFA/DCM溶液,在室溫下攪拌15分鐘。

          3. 樹(shù)脂分離與洗滌:反應(yīng)完成后,使用DCM充分洗滌樹(shù)脂,重復(fù)此步驟三次,然后用甲醇和乙醚分別洗滌樹(shù)脂。

          4. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥,最后進(jìn)行HF裂解操作。

 

特殊氨基酸的處理

          在某些肽合成中,肽鏈中可能包含特殊保護(hù)基團(tuán)的氨基酸殘基,如Trp(For)等。這些保護(hù)基團(tuán)可能需要在裂解前進(jìn)行特殊處理,以確保保護(hù)基團(tuán)的去除和避免副反應(yīng)。

 

          1. 使用哌啶去甲酰化

          對(duì)于含有甲?;Wo(hù)的Trp(For)肽樹(shù)脂,可以在裂解前使用哌啶處理以去除甲酰基。

 

          實(shí)驗(yàn)步驟:

          1. 樹(shù)脂溶脹:將肽樹(shù)脂在二甲基甲酰胺(DMF)中溶脹,通常需要溶脹30分鐘,以確保樹(shù)脂的每個(gè)位點(diǎn)都能充分接觸到哌啶溶液。

          2. 去甲?;磻?yīng):將溶脹后的樹(shù)脂置于0℃,加入20倍摩爾過(guò)量的哌啶: DMF混合液,攪拌2小時(shí)。

          3. 樹(shù)脂分離與洗滌:反應(yīng)完成后,將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到燒結(jié)玻璃漏斗中,依次用DMF甲醇和乙醚洗滌樹(shù)脂。

          4. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥,最后進(jìn)行裂解操作。

 

          2. 低-高裂解方法

          為了減少在高裂解條件下發(fā)生的副反應(yīng),可以采用低溫-高溫分段裂解法,首先在低溫下去除大多數(shù)芐基基團(tuán),然后在高溫下裂解剩余的保護(hù)基團(tuán)。

 

          實(shí)驗(yàn)步驟:

          1. 低溫裂解:將肽樹(shù)脂在冷卻至0℃的TFMSA或HF裂解混合物中攪拌30分鐘,以去除大部分芐基保護(hù)基團(tuán)。

          2. 高溫裂解:將反應(yīng)溫度升至室溫或更高溫度(如25-50℃),繼續(xù)反應(yīng)1-2小時(shí),以確保所有保護(hù)基團(tuán)都被去除。

          3. 樹(shù)脂分離與洗滌:裂解完成后,通過(guò)過(guò)濾分離樹(shù)脂,并依次用DCM、甲醇和乙醚洗滌樹(shù)脂。

          4. 樹(shù)脂干燥:將洗滌后的樹(shù)脂置于高真空下干燥,獲得裂解后的肽產(chǎn)物。

 

總結(jié)

          選擇適當(dāng)?shù)?a >Boc樹(shù)脂裂解方法對(duì)于確保肽合成的成功至關(guān)重要。每種方法都有其特定的應(yīng)用場(chǎng)景和要求,必須根據(jù)具體的氨基酸序列和保護(hù)基團(tuán)來(lái)做出最佳選擇。使用前的樹(shù)脂準(zhǔn)備、去保護(hù)步驟、裂解方法和肽的純化過(guò)程都需要仔細(xì)規(guī)劃,以避免副反應(yīng)并確保最終產(chǎn)物的純度和收率。

 

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