抗體應(yīng)用和技術(shù)
抗體是用于各種實驗室技術(shù)的強大研究工具。在此，我們將簡要介紹最流行的實驗室技術(shù)，重點介紹它們?nèi)绾问褂每贵w。
酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)
ELISA是一種基于平板的技術(shù)，可以檢測生物樣本中的抗原。與其他免疫測定方法一樣，ELISA依靠抗體與抗原的高度特異性相互作用來檢測目標(biāo)抗原。ELISA可以對分析物和分子相互作用進(jìn)行定量和定性。
在酶聯(lián)免疫吸附實驗中，抗原被直接固定在固體表面上，或者更常見的是通過捕獲抗體固定在表面上(圖1)。表面經(jīng)過洗滌，然后與酶或熒光團(tuán)等分子連接的檢測抗體一起孵育。
在抗原存在的情況下，這些檢測抗體會與平板保持結(jié)合，產(chǎn)生信號。信號的強度與樣本中的抗原濃度相對應(yīng)。
圖1:夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗裝置。多孔板上的捕獲抗體將固定感興趣的抗原。與生物素和鏈霉親和素-HRP結(jié)合的檢測抗體將識別并結(jié)合該抗原。
ELISA通常在多孔板(96孔或384孔)中進(jìn)行，分析物的固定化有助于將抗原與其他樣品成分分離。這些特點使ELISA成為最容易同時對多個樣品進(jìn)行檢測的方法之一。
酶聯(lián)免疫吸附法主要有四種：直接法、間接法、夾心法和競爭法，每種方法都有其獨特的優(yōu)缺點和適用性。每種實驗最合適的酶聯(lián)免疫吸附實驗形式取決與許多因素，包括所需的靈敏度、特異性和檢測時間。
酶聯(lián)免疫斑點檢測
酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)用于檢測細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子和生長因子。該技術(shù)可以量化和比較對各種刺激的免疫反應(yīng)。
將細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，使用抗體包被的PVDF或硝酸纖維素膜。使用一抗和共軛二抗檢測相關(guān)分泌蛋白。分泌相關(guān)蛋白的細(xì)胞會出現(xiàn)色斑或熒光。掃描并分析膜，量化分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量或比例。
免疫印跡(WB)
免疫印跡技術(shù)廣泛應(yīng)用于分離和鑒定蛋白質(zhì)的研究。通過免疫印跡，我們可以檢測蛋白質(zhì)，確定不同樣本之間的相對蛋白質(zhì)水平，并確定目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量，從而深入了解蛋白質(zhì)的翻譯后加工過程。
免疫印跡包括三個主要步驟：(1)按大小分離蛋白質(zhì)，(2)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，(3)使用一抗和二抗觀察目標(biāo)蛋白質(zhì)(圖2)。
第一步，將蛋白質(zhì)裝載到凝膠上，通過凝膠電泳按大小進(jìn)行分離。然后利用電流將蛋白質(zhì)條帶遷移到膜上。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上至關(guān)重要，因為用于電泳的凝膠為隨后的免疫染色提供了一個較差的表面，即抗體不會粘附在凝膠的蛋白質(zhì)上。
最后，用特異性抗體對膜進(jìn)行進(jìn)一步免疫染色，并用二抗和檢測試劑對膜進(jìn)行顯像。
圖2：免疫印跡簡圖
免疫沉淀(IP)和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)
免疫沉淀(IP)是一種分離和純化單個蛋白質(zhì)和復(fù)合蛋白質(zhì)的多功能技術(shù)。在這項技術(shù)中，抗體被固定在固相基質(zhì)(如磁珠/瓊脂糖珠)上，從復(fù)雜的溶液中捕捉抗原。
染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)用于確定特定蛋白質(zhì)是否與體內(nèi)特定DNA序列結(jié)合。通過ChIP，研究人員可以確定感興趣的蛋白質(zhì)在整個基因組中結(jié)合的特定基因和系列，為了解其調(diào)控功能和機制提供重要線索。
圖3:ChIP方案工作流程。進(jìn)行ChIP實驗的步驟:1.交聯(lián)，2.染色質(zhì)片段化，3.免疫沉淀，4.DNA 回收和純化，5.DNA 分析。
免疫組織化學(xué)(IHC)
免疫組織化學(xué)(IHC)是一種利用抗體-抗原相互作用來檢測組織切片中抗原分布和定位的方法(圖4)。雖然定量效果不如免疫印跡或ELISA，但I(xiàn)HC具有在完成組織中鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)勢。
IHC通常用于診斷癌癥等疾病的組織異常，IHC提供了寶貴的視角和支持。
IHC染色依賴于能識別目標(biāo)抗原的抗體。您可以使用顯色或熒光檢測系統(tǒng)來觀察抗體于抗原之間的相互作用。在色原檢測中，抗體與酶結(jié)合，當(dāng)抗體接觸色原是會產(chǎn)生彩色沉淀。在熒光檢測中，抗體與熒光團(tuán)結(jié)合。樣品制備和可視化技術(shù)多種多樣，所使用的方法應(yīng)根據(jù)樣本類型和所需的靈敏度而定。
圖4:左圖為正常人扁桃體組織(福爾馬林固定石蠟包埋切片)的熒光多重IHC染色?？筆D1(橙色)、抗PDL1(綠色)、抗CD68(黃色)、抗CD3(紅色)、抗Ki67(淡藍(lán)色)和抗PanCK(灰色)的合并染色。右圖為用抗Ki67抗體對福爾馬林固定石蠟包埋的正常人扁桃體切片進(jìn)行IHC染色。
免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)
免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)是利用標(biāo)記抗體研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分布。與IHC不同的是，這種技術(shù)側(cè)重于細(xì)胞樣本而不是組織塊。
在ICC染色中，針對相關(guān)蛋白質(zhì)的抗體被應(yīng)用于經(jīng)過固定和通透處理的細(xì)胞培養(yǎng)樣本。ICC有兩種類型：直接和間接。直接ICC使用的是共軛的一抗，而間接ICC使用的是未共軛的一抗，然后用共軛的二抗進(jìn)行檢測(圖5)。在大多數(shù)ICC實驗中，抗體都用熒光團(tuán)標(biāo)記，非常適合共定位研究。各種成像技術(shù)，如寬場顯微鏡、共聚焦顯微鏡或旋轉(zhuǎn)圓盤顯微鏡都可用于檢測信號。
圖5:左圖是用抗PDGFRA抗體(用Alexa Flour®488二抗檢測-綠色)和抗微管蛋白抗體(用Alexa Fluor®594二抗檢測-紅色)對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行間接ICC染色。右圖是用共軛的抗KRT14抗體(Alexa Fluor®647-紅色)和共軛的抗微管蛋白抗體(Alexa Fluor®488-綠色)進(jìn)行直接ICC檢測。細(xì)胞核用DAPI(藍(lán)色)染色。上圖顯示野生型細(xì)胞中的相關(guān)信號，下圖顯示基因敲除沒有的特定信號。圖像由共聚焦顯微鏡拍攝。
流式細(xì)胞儀和熒光激活細(xì)胞分揀
流式細(xì)胞儀是一種常用的激光技術(shù)，用于分析細(xì)胞或顆粒的特征(圖13)。該技術(shù)測量混合群體中與單個細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記抗體發(fā)出的熒光。此外，不同細(xì)胞對光的散射也可用于確定它們的大小和特性。
圖6:流式細(xì)胞儀概覽。
通過流式細(xì)胞儀，可以分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)，確定異質(zhì)細(xì)胞群中不同細(xì)胞類型的特征，評估分離亞群的純度，分析細(xì)胞大小和體積。它可同時對單個細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析。
熒光激活細(xì)胞分揀(FACS)是流式細(xì)胞術(shù)的一種衍生技術(shù)，它根據(jù)熒光標(biāo)記將細(xì)胞群物理分離成亞群。
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