固相多肽合成——高效策略，革新技術(shù)
固相肽合成技術(shù)（SPPS）是一種革命性的生物化學技術(shù)，自20世紀60年代問世以來，已成為合成肽和蛋白質(zhì)的主要方法。1963年，羅伯特·布魯斯·梅里菲爾德（Robert Bruce Merrifield）首次提出了固相肽合成的概念，這一突破性工作不僅極大地提高了肽合成的效率和可控性，還為他贏得了1984年的諾貝爾化學獎。
在固相肽合成中，肽鏈的生長是通過逐步加入氨基酸單體來實現(xiàn)的。與溶液相合成不同的是，固相肽合成中，肽鏈被固定在一個不溶性樹脂載體上，這樣可以簡化反應后的純化步驟。合成過程從C端氨基酸開始，通過在其α氨基上連接到樹脂載體上，然后依次將保護好的氨基酸逐一連接到生長中的肽鏈上。每次氨基酸連接完成后，通過簡單的過濾步驟去除反應中未反應的試劑和副產(chǎn)物，從而減少了傳統(tǒng)溶液相合成中需要復雜純化的步驟。
SPPS的核心在于兩個主要步驟：脫保護和偶聯(lián)。首先，肽鏈上的保護基團被移除，使得下一個氨基酸能夠結(jié)合到肽鏈的游離氨基上。常用的脫保護試劑包括三氟乙酸（TFA）和二異丙基乙胺（DIPEA），這些試劑能夠有效去除保護基而不損壞肽鏈。脫保護后，氨基酸被活化以便偶聯(lián)到生長中的肽鏈上。常用的偶聯(lián)試劑包括HBTU、HATU等，它們能夠促進氨基酸與肽鏈上的游離氨基形成肽鍵。
SPPS的主要優(yōu)勢在于其高效性和自動化潛力?，F(xiàn)代的自動化合成器可以在短時間內(nèi)合成數(shù)十個氨基酸長的肽鏈，使得合成復雜肽和小型蛋白質(zhì)變得可行。此外，由于合成是在固相載體上進行的，反應物和副產(chǎn)物可以通過簡單的洗滌步驟被除去，這大大簡化了后期的純化步驟。
在SPPS的發(fā)展過程中，出現(xiàn)了兩種主要的技術(shù)流派：Fmoc和Boc策略。這兩種方法的區(qū)別在于它們使用的氨基酸保護基團和脫保護條件。Fmoc策略使用9-芴甲氧羰基（Fmoc）作為保護基，脫保護時使用堿性條件，如哌啶，而Boc策略使用叔丁氧羰基（Boc）作為保護基，脫保護時使用酸性條件，如三氟乙酸。Fmoc策略由于其溫和的脫保護條件和較少的副產(chǎn)物形成，逐漸成為主流。
Boc策略是最早發(fā)展的固相肽合成方法之一，它使用叔丁氧羰基（Boc）作為氨基保護基團。在每個氨基酸殘基的連接過程中，Boc基團通過酸性條件（通常是三氟乙酸）去保護，暴露出氨基以進行下一步的肽鍵形成。與Boc策略相比，F(xiàn)moc策略的開發(fā)則是在為了避免酸性條件對肽鏈的潛在損傷的背景下提出的。Fmoc策略采用9-芴甲氧羰基（Fmoc）作為保護基團，利用堿性條件（通常是哌啶溶液）去除Fmoc基團，從而暴露氨基以進行下一步反應。
以Fmoc策略為例，首先，在合成開始前需要選擇合適的樹脂作為固相載體，常見的有聚苯乙烯樹脂（例如Wang樹脂或Rink amide樹脂），這些樹脂具有能夠與氨基酸形成共價鍵的官能團。合成反應的第一步是將C端氨基酸固定在樹脂上，通過與樹脂上活化的官能團反應，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。接下來，使用20%的哌啶溶液去除氨基酸上的Fmoc保護基團，暴露出游離的氨基。然后，加入下一步要連接的氨基酸，該氨基酸通常使用羧基活化劑（例如HBTU、HATU或DIC）進行預先活化，從而促進其與前一氨基酸的氨基形成肽鍵。這一循環(huán)過程在合成每個氨基酸時重復進行，直到整個多肽鏈合成完成。每次反應結(jié)束后，合成過程中使用的溶劑（如DMF、DCM）和副產(chǎn)物都可以通過簡單的洗滌步驟去除。
Boc策略的合成流程雖然與Fmoc策略類似，但其細節(jié)有所不同。Boc策略首先也是將C端氨基酸與樹脂載體偶聯(lián)，形成酰胺鍵。隨后，通過使用強酸性試劑（如三氟乙酸，TFA）去除氨基酸上的Boc保護基團，暴露出游離氨基。然后，加入下一個Boc保護的氨基酸，在存在羧基活化劑的條件下，形成肽鍵。與Fmoc策略不同，Boc策略中由于需要使用酸性條件進行脫保護，因此其應用可能對某些酸敏感的氨基酸或肽鏈有潛在的影響。盡管如此，Boc策略仍然在一些特定的肽合成中具有獨特的優(yōu)勢。
無論是Fmoc還是Boc策略，每個步驟的反應條件和試劑選擇都需精確控制，以確保多肽鏈的合成高效且準確。最終，通過從樹脂上切下肽鏈并進行純化，獲得目標多肽。兩種策略各自在特定應用中展現(xiàn)了獨特優(yōu)勢，為研究人員提供了靈活而強大的多肽合成手段。
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