方法一、葡萄糖母液發(fā)酵法
斜面培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備：取葡萄糖3g，硫酸鎂0.01g，磷酸二氫鉀0.012g，磷酸氫二銨0.022g，蛋白胨0.025g，碳酸鈣0.4g，瓊脂1.5g，加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH5.6-6.2。
將配好的培養(yǎng)基分裝于18mm×180mm試管中，高壓滅菌后，取出制成斜面，接入黑曲霉菌孢子02，于28-32℃恒溫培養(yǎng)7d，成熟后貯于冰箱保藏備用。
黑曲霉菌02[培養(yǎng)基]→[28-32℃, 7d]斜面菌落
固體孢子培養(yǎng) 培養(yǎng)基制備：取麩皮100g與葡萄糖混合液(葡萄糖 5g，碳酸鈣1g，常水加至100ml)143g混合均勻，分裝于1L三角燒瓶中，按常規(guī)滅菌，放冷。
在無菌操作下，接入斜面孢子的懸浮液中，如青霉素鉀鹽(2000單位)溶液約5ml，充分混勻，分裝于已滅菌的瓷盤中，蓋上玻璃片，于30-32℃培養(yǎng)4-7d，成熟后作為固體種源。
斜面菌落[培養(yǎng)基]→[30-32℃, 4-7d]固體種源
種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基配制：取葡萄糖母液(折還原糖計)5%，蛋白胨0.02%，硫酸鎂0.025%，碳酸鈣1.25%，磷酸二氫鉀0.03%，磷酸氫二銨0.08%，加水至100%，調(diào)節(jié)pH至5.8-6.2。
在種子罐中加入計量的種子培養(yǎng)基，加水至規(guī)定體積，常規(guī)滅菌，冷卻，通入空氣，待罐溫降至34℃時，移入瓷盤中的固體孢子及青霉素鉀鹽400000U，于30-32℃通風培養(yǎng)16-20h，當菌絲生長旺盛，無雜菌，糖轉(zhuǎn)化率達30%以上時，即得黑曲霉種子培養(yǎng)液。
固體種源[種子培養(yǎng)基]→[pH5.8-6.2, 30-32℃, 16-20h]黑曲霉種子培養(yǎng)液
發(fā)酵 培養(yǎng)基配制：葡萄糖母液(折還原糖計)10%，碳酸鈣2.9%，硫酸鎂0.0156%，磷酸二氫鉀0.0188%，磷酸氫二銨0.0388%，碳酸鈣2.9%，加水至100%。
在配料罐加入培養(yǎng)基，加水至規(guī)定體積，攪拌均勻后泵入發(fā)酵罐中，攪拌，通入壓縮空氣，然后自種子罐壓入黑曲霉種子培養(yǎng)液，并加入適量的青霉素鉀鹽抑制雜菌(2200L培養(yǎng)液中加入1200000U)或105-115℃半小時蒸氣滅菌，于29-31℃，罐壓49 kPa(0.5kgf/cm2)，通氣量0.3-0.5V/(V·min)，攪拌培養(yǎng)至糖分在10-15mg/ml以下，即達終點，得發(fā)酵液。
種子培養(yǎng)液[培養(yǎng)基，青霉素鉀鹽]→[29-31℃]發(fā)酵液
中和、脫色 將發(fā)酵液通蒸氣加熱到85℃左右，出料，布袋過濾，濾液中加入新配制的石灰乳中和至pH7.2, 并于90℃加適量活性炭脫色30min, 板框過濾，得脫色液。
發(fā)酵液[石灰乳，活性炭]→[pH7.2, 90℃]脫色液
濃縮、結(jié)晶 上述濾液在60-70℃溫度下減壓濃縮至相對密度達1.22, 30℃左右結(jié)晶， 離心分離，甩干，粉碎，烘干，即得口服用葡萄糖酸鈣。
脫色液[60-70℃, 30℃]→葡萄糖酸鈣成品
方法二、淀粉糖化發(fā)酵法
斜面培養(yǎng) 將黑曲霉菌87孢子接入斜面培養(yǎng)基（制法同葡萄糖母液發(fā)酵法), 于29-30℃恒溫培養(yǎng)7d, 成熟后接入三角燒瓶中，培養(yǎng)，再移入一級種子罐培養(yǎng)。
黑曲霉菌87[斜面培養(yǎng)基]→[29-31℃, 7d]斜面菌落
固體孢子培養(yǎng) 將麩皮100g混合與葡萄糖混合液（配方通母液發(fā)酵法）143g中，混合均勻，分裝1L三角燒瓶中，按常規(guī)滅菌后放冷。在無菌操作下，接入斜面孢子的懸浮液中，加入青霉素鉀鹽(2000U)溶液約5ml, 充分混勻，分裝于己滅菌的瓷盤內(nèi)，蓋上玻璃片，于30-32℃培養(yǎng)4-7d, 成熟后作固體種源。
斜面菌落[葡萄糖，CaCO3, 麩皮，青霉素鉀鹽]→[30-32℃, 4-7d]固體種源
種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基配制：玉米淀粉糖化液(折100%還原糖汁) 100ml, 硫酸鎂0.156g, 磷酸二氫鉀0.188g, 磷酸氫二銨0.388g, 碳酸鈣29g, 自來水加至1000ml, 調(diào)節(jié)pH至5.8-6.2。
將培養(yǎng)基經(jīng)夾層加熱至108-112℃滅菌40min, 通入過濾的壓縮空氣保壓，降壓，再加入營養(yǎng)鹽，移入固體霉菌孢子。接種完畢， 通氣攪拌培養(yǎng)， 控制空氣內(nèi)壓206-245.24kPa (2.1-2.5kgf/cm2), 溫度29-31℃, pH5.5-6.5, 攪拌24-26h, 使發(fā)酵原始糖從14%-15%下降到殘?zhí)?.8%以下，得種子培養(yǎng)液。
固體種源[種子培養(yǎng)基，營養(yǎng)鹽]→[pH5.5-6.5, 29-31℃, 24-26h]種子培養(yǎng)液
發(fā)酵 培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基基本相同，其中硫酸銨代替了磷酸氫二銨。將發(fā)酵罐及其附屬設備經(jīng)蒸氣滅菌后，加入培養(yǎng)基，通壓縮空氣，保持氣壓49-98kPa (0.5-1 kgf/cm2), 滅菌30-60min。 壓入種子培養(yǎng)液，接種量4.6%, 控制中29-31℃, pH5.5-6.6, 氣壓196.2-245.25 kPa (2-2.5kgf/cm2)， 攪拌185-195r/min, 培養(yǎng)24-26h, 發(fā)酵原始糖從14%-15%下降到時殘?zhí)?.8%以下為終點， 得發(fā)酵液。
種子培養(yǎng)液[玉米淀粉糖化液]→[pH5.5-6.6, 29-31℃, 24-26h]發(fā)酵液
中和、濃縮、初結(jié)晶 將發(fā)酵液加熱至80-85℃, 殺菌及凝固菌絲蛋白，同時加入石灰乳中和pH達7-7.2, 停止加熱，壓濾，得澄清液，含有葡萄糖酸鈣約16%-18%。加0.05%-0.2%磺化蓖麻油作消沫劑，在60-70℃、真空度72-89kPa (540-600 mmHg)下，濃縮至相對密度為1.082-1.084(90℃), 壓出，放置結(jié)晶，離心，得葡萄糖酸鈣粗品。
發(fā)酵液[石灰乳]→[pH7-7.2, 80-85℃]澄清濾液[磺化蓖麻油]→[60-70℃, 減壓]粗品
精制、結(jié)晶、干燥 將粗品用水或葡萄糖酸鈣結(jié)晶母液加熱溶解， 調(diào)節(jié)至相對密度為1.082-1.084 (90℃), 按粗品量13-15g/L (1.3%-1.5%)加入活性炭脫色，調(diào)節(jié)pH6.2-6.4, 靜置沉降（使懸浮雜質(zhì)隨活性炭沉淀）。過濾至清液，生產(chǎn)上往往循環(huán)過濾1.5-2h左右，80℃保溫防止結(jié)晶。放料，經(jīng)冷卻，出口溫度20-24℃, 加晶種放置結(jié)晶14-22h, 使結(jié)晶母液相對密度將至1.045-1.048 (20-24℃)離心，收集結(jié)晶，得口服葡萄糖酸鈣。如此重復結(jié)晶2次，干燥，得注射用葡萄糖酸鈣，收率82%, 含量99.6%。
粗品[水，活性炭]→[pH6.2-6.4, 80℃]澄清液→[20-24℃, 14-22h]口服葡萄糖酸鈣→[20-24℃, 14-22h]注射用葡萄糖酸鈣
注射劑的制備 取上述葡萄糖酸鈣精品，加注射用水，按注射劑規(guī)定滅菌，得熱源及其他均符合規(guī)定的無色的澄明液體。
葡萄糖酸鈣精品[注射用水]→[滅菌]葡萄糖酸鈣注射劑。 |