背景及概述^[1][2]

去甲金霉素，主要用于米諾環(huán)素和替加環(huán)素的生產(chǎn)。其抗菌性較強(qiáng)，抗菌譜與金霉素相似，其作用比四環(huán)素、土霉素強(qiáng)，比金霉素穩(wěn)定，當(dāng)前生物醫(yī)藥領(lǐng)域中重要的原料產(chǎn)品，但當(dāng)前在進(jìn)行去甲金霉素生產(chǎn)過(guò)程中，由于國(guó)外對(duì)我國(guó)長(zhǎng)期的技術(shù)封鎖，從而導(dǎo)致我國(guó)去甲金霉素產(chǎn)品生產(chǎn)工作相對(duì)滯后，缺乏高效可靠，且成本低廉的去甲金霉素產(chǎn)品生產(chǎn)工藝。

而在去甲金霉素產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，去甲金霉素菌株培育及篩選是確保去甲金霉素產(chǎn)品生產(chǎn)效率質(zhì)量的重要基礎(chǔ)，而當(dāng)前在進(jìn)行對(duì)去甲金霉素菌株培育和篩選作業(yè)時(shí)，所采用的方法和工藝往往均為借鑒同類(lèi)或相似菌種培育及篩選方法開(kāi)展，雖然一定程度可以滿(mǎn)足去甲金霉素菌株培育及篩選的需要，但工作效率低下，成本相對(duì)較高，易產(chǎn)生大量的污染性廢棄物，且菌株培育質(zhì)量穩(wěn)定性和篩選精度均相對(duì)較差，嚴(yán)重影響了甲金霉素產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。

理化性質(zhì)^[1]

去甲金霉素，別名地美環(huán)素、去甲基氯四環(huán)素等，是由金色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的四環(huán)素類(lèi)抗生素，用于原料藥其抗菌譜與金霉素相似，抗菌效果比四環(huán)素強(qiáng)，比金霉素穩(wěn)定。隨著衍生物米諾環(huán)素和替加環(huán)素相繼上市和其他衍生物的持續(xù)開(kāi)發(fā)，去甲金霉素的市場(chǎng)前景越來(lái)越廣闊。

傳統(tǒng)的去甲金霉素發(fā)酵生產(chǎn)提取方法是將去甲金霉素發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理、板框后濾、濾液使用醋酸丁酯和丁醇進(jìn)行萃取，然后使用鹽酸反萃取濃縮再結(jié)晶、烘干得到去甲金霉素鹽酸鹽，傳統(tǒng)工藝使用大量的醋酸丁酯和丁醇，且二溶劑均具有很高的水溶性，故而三廢排放嚴(yán)重，環(huán)境處理成本大增；且由于發(fā)酵液的復(fù)雜性和有機(jī)溶劑萃取局限性，造成萃取困難，產(chǎn)品質(zhì)量和收率均受到不同影響。

制備^[2]

一種高效去甲金霉素菌株培育及篩選方法：

步，配置培養(yǎng)母液，首先根據(jù)使用需要，在培養(yǎng)釜中配置去甲金霉素菌株培養(yǎng)母液，然后在10分鐘內(nèi)，將去甲金霉素菌株培養(yǎng)母液勻速升溫至25℃并保溫，然后對(duì)去甲金霉素菌株培養(yǎng)母液進(jìn)行30分鐘超聲波乳化作業(yè)，并在完成超聲波乳化作業(yè)后對(duì)去甲金霉素菌株培養(yǎng)母液保溫靜置10分鐘，然后將配制好的培養(yǎng)母液分為三部分，并分別承載在三個(gè)相互獨(dú)立的反應(yīng)釜中，同時(shí)在其中一部分培養(yǎng)母液中添加生物標(biāo)記物，然后超聲波混合3分鐘，制備得到生物標(biāo)記液；

第二步，菌種接種，首先在無(wú)菌環(huán)境避光條件下，對(duì)培養(yǎng)皿和過(guò)承載架進(jìn)行輻照滅活處理，然后通過(guò)菌種接種裝置將去甲金霉素菌種均與涂布在若干培養(yǎng)皿上表面，讓后將各培養(yǎng)皿通過(guò)承載架沿豎直方向進(jìn)行交錯(cuò)固定，且各培養(yǎng)皿上表面均與水平面平行分布，即可完成菌種接種；

第三步，菌種培育，將完成接種后的培養(yǎng)皿和承載架一同浸入到步中分離開(kāi)的其中一部分培養(yǎng)母液中，并使培養(yǎng)皿和承載架上端面低于培養(yǎng)母液液面5毫米，然后在25℃恒溫環(huán)境下培育2天，即可得到將去甲金霉素菌株；且培育過(guò)程中，3小時(shí)/次的頻率對(duì)培養(yǎng)母液進(jìn)行超聲波攪拌，且超聲波攪拌頻率為0.2MHz，每次超聲波振蕩時(shí)間為20分鐘；

第四步，熒光標(biāo)記，完成第三步作業(yè)后，將培養(yǎng)釜中用于浸泡培養(yǎng)皿和承載架的培養(yǎng)母液排空，并選擇各培養(yǎng)皿中的其中一個(gè)為標(biāo)的培養(yǎng)皿，然后將步配置的培養(yǎng)母液中的另一部分培養(yǎng)母液噴淋到標(biāo)的培養(yǎng)皿外的各培養(yǎng)皿中，將生物標(biāo)記液噴淋到標(biāo)的培養(yǎng)皿中，且培養(yǎng)母液與生物標(biāo)記液噴淋參數(shù)保持一致條件下，以5次/10小時(shí)的頻率進(jìn)行均勻噴淋至標(biāo)的培養(yǎng)皿外的各培養(yǎng)皿和標(biāo)的培養(yǎng)皿中，并在25℃恒溫環(huán)境下持續(xù)培育5天，且培育過(guò)程中，培養(yǎng)皿上端面的培養(yǎng)母液液面高出培養(yǎng)皿上端面的將去甲金霉素菌種上端面1毫米，并在每次完成培養(yǎng)母液噴淋后，對(duì)各培養(yǎng)皿進(jìn)行100r/min振蕩條件下持續(xù)勻速振蕩10分鐘，且振蕩時(shí)培養(yǎng)面上端面與水平面間夾角為30°；

第五步，篩選，將經(jīng)過(guò)培育后第四步中標(biāo)的培養(yǎng)皿中的去甲金霉素菌株進(jìn)行生物標(biāo)記物濃度檢測(cè)，并根據(jù)生物標(biāo)記物濃度分布區(qū)域?qū)?biāo)的培養(yǎng)皿中去甲金霉素菌株進(jìn)行劃分，然后根據(jù)標(biāo)的培養(yǎng)皿中去甲金霉素菌株進(jìn)行劃分分布結(jié)構(gòu)，依次對(duì)剩余各培養(yǎng)皿中菌株進(jìn)行相同分布結(jié)構(gòu)的劃分，從而即可完成不同菌株質(zhì)量劃分篩選作業(yè)；

第六步，濃縮提純，根據(jù)第五步劃分篩選的結(jié)果，對(duì)除標(biāo)的培養(yǎng)皿外的其他培養(yǎng)皿中的同區(qū)域內(nèi)的去甲金霉素菌株進(jìn)行分類(lèi)收集匯合，然后將不符合標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)域內(nèi)的去甲金霉素菌株進(jìn)行去除并無(wú)害化處理，對(duì)各區(qū)域內(nèi)的去甲金霉素菌株的濃度機(jī)發(fā)育狀態(tài)分別進(jìn)行濃縮提純，并使?jié)饪s提純后各區(qū)域內(nèi)的去甲金霉素菌株的濃度機(jī)發(fā)育狀態(tài)保持一致后進(jìn)行二次匯合即可得到成品。

提取

將含有6.0g/L去甲金霉素的發(fā)酵液35升，調(diào)節(jié)溫度至5-10℃加入0.05wt％亞硫酸鈉35g，調(diào)節(jié)溫度至10℃，使用草酸調(diào)節(jié)pH＝1.5±0.2，攪拌20分鐘，使用南京久吾公司陶瓷膜過(guò)濾，陶瓷膜通量30升/小時(shí)；得濾液70升；

將濾液過(guò)122樹(shù)脂，流速2BV/h，完成后使用pH＝6.8-7.0的飲用水頂洗0.5小時(shí)，得脫色液72升；

將脫色液過(guò)截留分子量為150道爾頓的美國(guó)GE公司有機(jī)納濾膜組件，壓力1.5mpa，溫度保持5-10℃；得濃縮液4升；

將濃縮液攪拌條件下，調(diào)節(jié)溫度5-8℃，使用0.1M的氨水調(diào)節(jié)pH＝6.5±0.2，得到沉淀懸浮液，繼續(xù)攪拌30分鐘，靜置30分鐘，固液分離得去甲金霉素粗品；

將去甲金霉素粗品使用尿素復(fù)鹽法精制得去甲金霉素成品，烘干得去甲金霉素鹽酸鹽152g，總收率72.38％；成品送檢符合EP、USP標(biāo)準(zhǔn)。

主要參考資料

[1] 林桂真, 葉蕊芳, 程林同, & 毛全貴. (2014). 常壓室溫等離子體誘變高產(chǎn)去甲金霉素金色鏈霉菌. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 45(11).

[2] 蘇玉山, 苗勇, 亓平言, 王冰, SuYu-shan, & MiaoYong等. (2000). 去甲金霉素提取新工藝研究. 中國(guó)抗生素雜志, 25(5), 341-343.

[3] 李士杭[1], 葉蕊芳[1], 呂和平[2], 毛全貴[2], & 戴維[2]. (2012). 去甲金霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及機(jī)制分析. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志, 43(11), 896-902.