背景^[1-6]

破膜劑用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色前對細(xì)胞膜的處理。固定劑起穩(wěn)定細(xì)胞膜、保持細(xì)胞膜表面抗體與抗原結(jié)合的作用；破膜劑使流動的、完整的細(xì)胞膜產(chǎn)生小孔以利于抗體進(jìn)入細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)抗原及DNA時，對待測細(xì)胞進(jìn)行固定、破膜處理后，加入相應(yīng)抗體或檢測試劑，孵育一定時間即可上機(jī)分析。細(xì)胞破壁技術(shù)一種高科技手段，其應(yīng)用十分廣泛。除病毒外，一切生物均由細(xì)胞構(gòu)成，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)核結(jié)構(gòu)分化程度的不同，細(xì)胞可以分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類型。

細(xì)胞壁（cellwall）是細(xì)胞的外層，在細(xì)胞膜的外面，細(xì)胞壁之厚薄常因組織、功能不同而異。植物、真菌、藻類和原核生物都具有細(xì)胞壁，而動物細(xì)胞不具有細(xì)胞壁。細(xì)胞壁本身結(jié)構(gòu)疏松，外界可通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞中。

破膜主要分為以下幾步：

（1）用醛類（多聚甲醛、甲醛、戊二醛）或有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇、丙酮）固定或穩(wěn)定細(xì)胞膜。醛類在固定的同時可以增加細(xì)胞滲透性，但還不足以使抗體進(jìn)入。但如果用有機(jī)溶劑固定，那么后續(xù)的破膜就不需要了。

（2）用去污劑或溶劑破膜。

（3）將細(xì)胞與胞內(nèi)抗體或標(biāo)記物孵育。

常用的破膜方法主要包括：

（1）有機(jī)溶劑：例如甲醇、丙酮等，這類溶劑主要通過溶解膜脂質(zhì)、凝結(jié)膜蛋白實現(xiàn)固定和破膜。

（2）去污劑：這類試劑可在胞膜上形成一個孔實現(xiàn)破膜。

細(xì)胞免疫熒光的詳細(xì)操作步驟：

1，取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心。

2，4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3，0.2%Triton X 100通透10分鐘，PBS洗三遍。

4， 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5，一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。

6，二抗室溫2小時，或者37度1半小時，PBS洗三遍。

7，用DAPI染核，然后直接照熒光片。

8，蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

應(yīng)用^[7][8]

可用于流式細(xì)胞術(shù)檢測兒童白血病細(xì)胞磷酸化信號蛋白的初步研究：

采用Phospho-flow技術(shù)檢測初診兒童白血病細(xì)胞磷酸化蛋白即P-AKT、P-ERK1/2和P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5、P-STAT6的表達(dá),分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERKJAK/STAT通路與患兒危險分型、藥物治療反應(yīng)之間以及急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia ,ALL)高危分型之間的關(guān)系,探討Phospho-flow技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。

目的1.在本實驗室建立流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病患兒骨髓或外周血細(xì)胞磷酸化信號蛋白的磷酸化流式細(xì)胞技術(shù);2.采用磷酸化流式細(xì)胞術(shù)檢測白血病患兒骨髓或外周血白血病細(xì)胞內(nèi)信號通路磷酸化蛋白的表達(dá),了解兒童白血病細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白P-ERK1/2、P-AKT、P-STAT1、P-STAT3、P-STAT5和P-STAT6的表達(dá),分析PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT通路與患兒危險分型、藥物治療反應(yīng)之間以及ALL高危分型之間的關(guān)系,探討Phospho-flow技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。

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