背景^[1-6]

細(xì)胞中提取總RNA的方法是用含有異硫氰酸胍和酚的一種單相液來裂解細(xì)胞，異硫氰酸狐是一種常見且有效的蛋白質(zhì)變性劑，在裂解細(xì)胞的同時能有效抑制內(nèi)源性RNA酶活性。同時加入氯仿產(chǎn)生了第二相（有機(jī)相），DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)相中被抽提，低pH值的酚將使RNA留在上層水相中。水相中的RNA可用異丙醇沉淀濃縮,隨后用乙醇洗滌沉淀，即可去除所有殘留的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，最終獲得總RNA。

1.細(xì)胞或者組織樣品勻漿處理

(1)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞量為107,無須用胰蛋白酶消化，在去除培養(yǎng)液后，用預(yù)冷無菌PBS洗細(xì)胞一次，去上清，再加入1mL單相裂解液裂解細(xì)胞，可用槍頭吹打混勻，使細(xì)胞裂解完全，最后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管。

(2)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：細(xì)胞量為107,可直接轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，500 rpm離心5 min后；用預(yù)冷無菌PBS洗滌1次，棄上清，再加入1mL單相裂解液懸浮細(xì)胞沉淀，可用槍頭吹打混勻，使細(xì)胞裂解完全，最后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管。

(3)組織樣品：解剖所要的組織后，先將這些組織切成小塊（100 mg),然后將組織放入盛有液氮的研缽中，用研棒磨碎組織，使組織成粉末狀。在研磨過程中要不斷添加液氮使組織保持冷凍狀態(tài)，最后加入1mL單相裂解液裂解組織細(xì)胞，再轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管。

2.RNA提取

(1)樣品加入單相裂解液后，室溫放置5 min,使樣品充分裂解。如不進(jìn)行下一步操作，樣品可放入-70℃長期保存。

(2)如果樣品中含有較多蛋白、脂肪、多糖等，12000 rpm離心5 min,取上清。

(3)按每1mL單相裂解液加入200μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min,使其自然分相。禁用旋渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。

(4)4℃12 000 rpm離心15 min后，樣品會分成三層，黃色的有機(jī)層，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中。

(5)小心吸取上層水相，至另一個新的1.5 mL離心管中。不要吸取中間界面，以免DNA和蛋白污染。

(6)在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，-20℃放置1h以增加RNA沉淀。

(7)4℃12 000 rpm離心10min，棄上清，RNA沉于管底。

(8)RNA沉淀加入1mL 75%乙醇（用DEPC水配置），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。

(9)4℃8 000 rpm離心5 min,盡量棄上清。用移液器小心吸棄上清，注意不要吸走RNA沉淀。

(10)室溫晾干5?10 min,讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)。RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。

(11)用50μL DEPC水或者TE溶解RNA沉淀，RNA溶液要放在-70℃保存。純水和TE均需DEPC處理并經(jīng)高壓消毒。

3.RNA定量

RNA提取完就應(yīng)該來做RNA定量，RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260 nm波長處有的吸收峰。因此，可以用260 nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/mL的單鏈RNA。如用1cm光徑，用ddH20稀釋DNA樣品n倍并以ddH20為空白對照，根據(jù)此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度：

RNA(mg/mL)=40x(OD260讀數(shù)）x稀釋倍數(shù)(n)/1000

純RNA的OD260/OD280的比值為1.8-2.0,根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計RNA的純度。若比值比1.8低，說明有殘余蛋白質(zhì)、酚或者其他雜質(zhì)存在；比值比2.0高，則提示RNA有降解。

4.RNA凝膠電泳

RNA的電泳目的是檢測28S和18S條帶的完整性和它們的比值，或者是mRNA Smear的完整性，可以用普通的瓊脂糖膠進(jìn)行。如果28S和18S條帶明亮、清晰，沒有出現(xiàn)涂抹狀片段，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，則可判斷認(rèn)為RNA提取的質(zhì)量是好的。

應(yīng)用^[7][8]

細(xì)胞RNA提取可用于小鼠骨骼肌發(fā)育相關(guān)環(huán)狀RNA的鑒定和功能研究：

環(huán)狀RNA是一種廣泛存在于生物界的一種非編碼RNA,是mRNA前體選擇性剪切形成的產(chǎn)物。環(huán)狀RNA主要由外顯子環(huán)化形成,少部分由內(nèi)含子形成,還有部分由外顯子和內(nèi)含子共同形成。研究表明,環(huán)狀RNA具有海綿(sponge)作用,充當(dāng)miRNA的環(huán)狀抑制劑,調(diào)控miRNA靶標(biāo)發(fā)揮作用,參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控,進(jìn)而參與機(jī)體的調(diào)控功能。以C2C12小鼠成肌細(xì)胞為模型,通過芯片篩選出與肌肉發(fā)育相關(guān)的兩條環(huán)狀RNA--Circ2196和Circ2179,主要研究其對C2C12細(xì)胞增殖、分化的影響。實驗結(jié)果表明Circ2179可以促進(jìn)細(xì)胞的分化,Circ2196可以抑制細(xì)胞的增殖。為研究其作用機(jī)制,對這兩個環(huán)狀RNA進(jìn)行細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)二者均主要位于細(xì)胞質(zhì)中,為研究環(huán)狀RNA的海綿(sponge)作用奠定了基礎(chǔ)。

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