背景及概述^[1]

細(xì)胞色素P450（cytochromeP450，CYP450）是主要分布于肝微粒體的藥物主要代謝酶，參與脂肪酸、類花生四烯酸等多種內(nèi)源性物質(zhì)及藥物、毒物、致癌物、前致癌物等外源性化合物的代謝，其主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5等，參與70%~80%臨床常用藥物的代謝。CYP450含量和活性影響藥物在體內(nèi)的代謝消除，其個(gè)體差異是導(dǎo)致藥物效應(yīng)差異的主要原因。體內(nèi)研究多通過CYP450探針?biāo)幬锏捏w內(nèi)藥動(dòng)學(xué)來反映代謝情況，即將藥動(dòng)學(xué)的個(gè)體差異歸因于藥物代謝差異，如CYP450基因多態(tài)性影響藥物代謝的結(jié)論多由此獲得。但體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)除受代謝影響外，亦受吸收、分布和排泄過程的影響。體外研究多停留在肝微粒體、肝細(xì)胞、重組酶等代謝體系中。由于標(biāo)本數(shù)量所限，肝微粒體研究難以涉及CYP450代謝活性的個(gè)體差異及影響因素，重組酶難以反映肝臟的實(shí)際狀況。

含量測定^[1]

小鼠CYP450酶含量的測定：CYP450為血紅素蛋白，其還原型與CO結(jié)合后，在波長450nm處出現(xiàn)吸收峰，故可通過測定溶液的吸光度值，反映溶液中CYP450酶的含量。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 分組：先將小鼠逐一稱重，按照體重由小到大（或由大到?。┡判?。根據(jù)簡化隨機(jī)原則將小鼠分為3組（甲、乙、丙），每組3只。

2. 腹腔注射給藥　甲組為0.75%苯巴比妥鈉溶液，乙組為0.002%放線菌素D溶液，丙組為生理鹽水。每組小鼠均連續(xù)給藥3天。

3. 制備肝勻漿　小鼠處死，取出肝臟，注意勿破壞膽囊。稱重后，將肝組織置于玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷后的0.25mol/L蔗糖液（0.5ml/100mg肝組織），冰浴下研磨至淡粉色勻漿。然后4攝氏度下10,000 g離心20 min后，留取上清液。

4. 小鼠肝細(xì)胞CYP450酶含量的測定　取離心后上清液1ml，加入預(yù)冷后的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液9ml，充分混勻。冰浴下通CO氣，1~2氣泡/s，通氣2min。將通氣完畢的溶液分為兩半，分別置于兩個(gè)試管中：其一作為測定吸光度時(shí)的參照杯，另一加入連二亞硫酸鈉5mg，充分混勻，即為待測樣品杯。測定并記錄樣品杯在450nm和490nm波長下的吸光度值（表23-4）。

5. 計(jì)算小鼠肝細(xì)胞CYP450酶含量

根據(jù)公式A = E·C·L，其中A：吸光度；E：490nm到450nm波長的示差光譜消光系數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中E = 104L/cm·mmol；C：CYP450濃度；L：比色杯厚度（光路長度），本實(shí)驗(yàn)中比色杯為1cm。因此，得到CYP450（nmol/g肝臟）= [(A450 - A490) / E·L]×50000

6. 小鼠肝細(xì)胞CYP450酶的誘導(dǎo)和抑制

（1） CYP P450升高百分率：

[(苯巴比妥組-生理鹽水對照組) /生理鹽水對照組]×100%

（2） CYP P450降低百分率：

[(生理鹽水對照組-放線菌素D組) /生理鹽水對照組]×100%

主要參考資料

[1] 人肝人肝細(xì)胞CYP450酶含量與活性研究進(jìn)展