背景[1-5]
Miser Antibody Extender Solution NC可以顯著降低使用硝酸纖維素膜進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡所需的初級(jí)的抗體量。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，Miser Antibody Extender Solution NC處理只需幾分鐘即可完成一抗孵育。Miser Antibody Extender Solution NC處理后的Western印跡化學(xué)發(fā)光和顯色檢測(cè)方法表現(xiàn)良好。
一抗抗體量的減少會(huì)減弱抗原特異性，而且Miser Antibody Extender Solution NC不建議用于轉(zhuǎn)移到PVDF膜的抗原一抗孵育處理。Werstern blot，是將印跡技術(shù)與抗原-抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，用于分離和檢測(cè)生物標(biāo)本中的某一特定蛋白。其基本原理實(shí)混合蛋白質(zhì)樣本通過(guò)凝膠電泳分離后，通過(guò)特殊虹吸或電場(chǎng)裝置印跡至固相介質(zhì)（NC膜或PVDF膜）上，將針對(duì)待測(cè)蛋白的特異性抗體作用于濾膜上，利用抗體上偶聯(lián)的酶降解底物在濾膜上生成有色沉淀物或化學(xué)發(fā)光產(chǎn)物，從而顯示出待測(cè)蛋白的存在及量。
實(shí)驗(yàn)流程：
一.樣本制備
樣本的來(lái)源：細(xì)胞培養(yǎng)上清；細(xì)胞（胞漿蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；組織勻漿；蛋白的提取：（裂解前加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑使其終濃度為1mM）樣本上樣前的處理:蛋白提取液和SDS上樣緩沖液（Loading buffer）以一定的比例上樣；蛋白變性：95-100℃變性5分鐘（為了能使抗體接觸到抗原表位，必須將蛋白的三維結(jié)構(gòu)打開(kāi)，因此需要將蛋白變性，核蛋白要增加裂解液體積和超聲破碎次數(shù)，煮樣時(shí)間延長(zhǎng)至10-15min）。
二、上樣與電泳
原理：裂解后的蛋白質(zhì)樣本經(jīng)過(guò)高速離心去除不溶物后，再經(jīng)SDS上樣緩沖液95-100℃變性5分鐘，使帶有強(qiáng)負(fù)電荷的SDS與帶有弱電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，大量的SDS可掩蓋蛋白質(zhì)本身的電荷量，只顯示SDS的負(fù)電荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不連續(xù)SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠）系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的電泳與自身電荷量無(wú)關(guān)，只和其分子大小有關(guān)，從而將蛋白質(zhì)按分子量大小順序分離。
上樣：一般每孔上樣20-50ug總蛋白，100ng純蛋白。根據(jù)膠的厚度不同，上樣總體積也不同：一般來(lái)說(shuō)，10mm的膠最多可上樣20ul；15mm膠最多上樣30ul。
電泳：濃縮膠80V；分離膠120V（100V也可），電壓越大分離越快，電泳時(shí)間一般1-2 h，電泳至溴酚蘭即將跑出膠即可終止電泳。
三、轉(zhuǎn)膜
一般分為：濕式電印跡-的轉(zhuǎn)膜方法，半干式電印跡-可選的替代轉(zhuǎn)膜方法，干式電印跡-有限靈敏度的轉(zhuǎn)膜方法。
四、封閉
對(duì)轉(zhuǎn)印膜空白位點(diǎn)的封閉，一般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑封閉整張膜，常用5%脫脂奶粉、0.5%-2%BSA、10%血清（馬/羊）和0.2%Tween20等。脫脂奶粉是常用的封閉劑，通常使用TBST+5%的脫脂奶粉但不能與生物素化的抗體一起使用，此時(shí)可以用BSA。使用辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)，封閉液后續(xù)不加疊氮鈉（抑制HRP）。在含有封閉液的平皿中，接觸膠的那面膜要朝上。
抗體孵育與檢測(cè)：
孵育一抗：按要求用TBST/PBS稀釋抗體，室溫：1.5-2h，或者4℃過(guò)夜。孵育二抗：抗體的標(biāo)記一般有酶標(biāo)和熒光標(biāo)記兩種，室溫：1.5-2h。顯影，主要有：酶促底物DAB顯色法（是HRP的常用底物），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）,熒光二抗顯影法。最后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。
應(yīng)用[6][7]
Miser Antibody Extender Solution NC可用于急性髓性白血病耐藥相關(guān)miRNA分子功能及作用機(jī)制研究：
急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的惡性克隆性疾病,嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康。白血病多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的關(guān)鍵因素,也是造成白血病患者復(fù)發(fā)、難治的重要原因。白血病多藥耐藥是指白血病細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥后,同時(shí)對(duì)不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和不同作用機(jī)理的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象,包括原發(fā)性耐藥與繼發(fā)性耐藥。
MDR產(chǎn)生機(jī)制非常復(fù)雜,包括藥物外排介導(dǎo)的耐藥、MDR相關(guān)酶類(lèi)異常所致耐藥、藥物作用靶點(diǎn)基因突變、腫瘤干細(xì)胞、細(xì)胞凋亡受抑、周期阻滯、藥代動(dòng)力學(xué)的改變等。MicroRNA(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度為19-25nt,序列高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA分子。成熟miRNA通過(guò)與目的基因3’端非編碼(3’-UTR)區(qū)結(jié)合促使靶基因抑制或蛋白降解,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá),廣泛參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、免疫系統(tǒng)、個(gè)體發(fā)育以及機(jī)體代謝等一系列生命過(guò)程。
Lipofectamine2000分別將miR-29b模擬物(mimic)或抑制劑(inhibitor)及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染AML敏感與耐藥細(xì)胞株,48小時(shí)后收集各組細(xì)胞,Real time RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-29b表達(dá)情況。分別包裝攜帶AF1q表達(dá)載體或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐藥細(xì)胞株,上調(diào)或下調(diào)AF1q表達(dá),48小時(shí)后熒光顯微鏡觀測(cè)感染效率,應(yīng)用Blastin藥物篩選獲得穩(wěn)定感染細(xì)胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法檢測(cè)病毒感染穩(wěn)篩后AF1q表達(dá)情況。
參考文獻(xiàn)
[1]Diverse roles of miR-29 in cancer(Review)[J].Hesong Jiang,Guang Zhang,Jun-Hua Wu,Chun-Ping Jiang.Oncology Reports.2014(4)
[2]miR-181b modulates glioma cell sensitivity to temozolomide by targeting MEK1[J].Jie Wang,Ke Sai,Fu-rong Chen,Zhong-ping Chen.Cancer Chemotherapy and Pharmacology.2013(1)
[3]miR-29b suppresses CML cell proliferation and induces apoptosis via regulation of BCR/ABL1 protein[J].Yajuan Li,Haixia Wang,Kun Tao,Qing Xiao,Zhenglan Huang,Liang Zhong,Weixi Cao,Jianping Wen,Wenli Feng.Experimental Cell Research.2013(8)
[4]Acute myeloid leukaemia in adults[J].Felicetto Ferrara,Charles A Schiffer.The Lancet.2013(9865)
[5]miR-503 regulates the resistance of non-small cell lung cancer cellsto cisplatin by targeting Bcl-2[J].Tianzhu Qiu,Li Zhou,Tongshan Wang,Jing Xu,Jian Wang,Wenjiao Chen,Xin Zhou,Zebo Huang,Wei Zhu,Yongqian Shu,Ping Liu.International Journal of Molecular Medicine.2013(3)
[6]MiR-181a enhances drug sensitivity in mitoxantone-resistant breast cancer cells by targeting breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2)[J].Xuyang Jiao,Lin Zhao,Mengtao Ma,Xuefeng Bai,Miao He,Yuanyuan Yan,Yan Wang,Qiuchen Chen,Xinnan Zhao,Mingyi Zhou,Zeshi Cui,Zhihong Zheng,Enhua Wang,Minjie Wei.Breast Cancer Research and Treatment.2013(3)
[7]盧菲.急性髓性白血病耐藥相關(guān)miRNA分子功能及作用機(jī)制研究[D].山東大學(xué),2014.