背景[1-6]
GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody(GA1R)是GAPDH Loading Control作為抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫后篩選出只產(chǎn)生的GAPDH Loading Control抗體的B淋巴細(xì)胞，再將B細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)與骨髓瘤雜交然后篩選出只分泌GAPDH Loading Control抗體的雜交瘤細(xì)胞，最后通過(guò)層析柱純化制的高純度的GAPDH Loading Control抗體。GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是通常已知參與糖酵解的催化酶。GAPDH作為相同37-kDa亞基的四聚體存在，并且在NADPH存在下催化1,3-二磷酸甘油酸酯可逆地還原為甘油醛3-磷酸酯。除了在糖酵解中發(fā)揮關(guān)鍵作用外，GAPDH普遍表達(dá)并顯示與其糖酵解功能無(wú)關(guān)的其他活性。
據(jù)報(bào)道，GAPDH參與DNA復(fù)制，DNA修復(fù)，核RNA輸出，膜融合和微管捆綁的過(guò)程。研究提供了GAPDH在凋亡中觀察到的基因表達(dá)的重要部分以及作為年齡相關(guān)神經(jīng)變性疾病的細(xì)胞表型的一部分的證據(jù)。此外，GAPDH參與其他細(xì)胞過(guò)程，包括膜融合和癌癥中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。據(jù)報(bào)道，GAPDH與多種其他蛋白質(zhì)結(jié)合，包括淀粉樣蛋白前體蛋白，導(dǎo)致某些形式的阿爾茨海默?。ˋD）的突變，以及亨廷頓蛋白產(chǎn)品異常形式的亨廷頓病的多聚谷氨酰胺束。還報(bào)道了GAPDH，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白之間的關(guān)聯(lián)。由于GAPDH在大多數(shù)組織中以高水平表達(dá)，因此在蛋白質(zhì)印跡分析中作為蛋白質(zhì)上樣對(duì)照是有用的。還報(bào)道了GAPDH，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白之間的關(guān)聯(lián)。
由于GAPDH在大多數(shù)組織中以高水平表達(dá)，因此在蛋白質(zhì)印跡分析中作為蛋白質(zhì)上樣對(duì)照是有用的。還報(bào)道了GAPDH，肌動(dòng)蛋白和微管蛋白之間的關(guān)聯(lián)。由于GAPDH在大多數(shù)組織中以高水平表達(dá)，因此在蛋白質(zhì)印跡分析中作為蛋白質(zhì)上樣對(duì)照是有用的。
應(yīng)用[7][8]
用于GAPDH作為原核及真核生物通用型內(nèi)標(biāo)蛋白的研究及相關(guān)生物技術(shù)研發(fā)。
甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是生物體內(nèi)一類(lèi)十分保守的重要多功能酶類(lèi)，廣泛存在于原核及真核生物體內(nèi)，如大腸桿菌、酵母、秀麗線(xiàn)蟲(chóng)、大鼠和小鼠等模式生物，主要參與生物體內(nèi)糖代謝中糖酵解的第六步反應(yīng)，即催化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸并釋放出能量(ATP)的過(guò)程。生物界中GAPDH單體分子量大小在30kD-40kD之間，天然狀態(tài)的GAPDH主要以四聚體形式存在，其氨基酸編碼序列在原核及真核生物體內(nèi)均高度保守，同源性高達(dá)76%。
原核及真核生物體內(nèi)GAPDH蛋白是一類(lèi)功能上十分保守的重要蛋白酶超家族，在不同的物種中分別由不同的基因編碼，如微生物的gapA,gapB和gapC基因、酵母菌的TDH-1,TDH-2和TDH-3基因、秀麗線(xiàn)蟲(chóng)的gpd-1,gpd-2,gpd-3和gpd-4基因、大鼠的G3PDH基因等。不同物種中多種編碼基因的存在一方面提示了不同GAPDH變體之間的功能代償性，另一方面反映了個(gè)體應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力的高度可調(diào)控性，為其作為管家蛋白的功能保守性提供了重要依據(jù)。內(nèi)標(biāo)蛋白是生物體內(nèi)一類(lèi)重要的管家蛋白，具有序列保守性高、組織分布廣等特點(diǎn)。如常見(jiàn)的內(nèi)標(biāo)蛋白主要包括：細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白actin、微管蛋白Tubulin、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白GAPDH等。其中，GAPDH在同種細(xì)胞或組織中的蛋白表達(dá)量相對(duì)恒定，且很少受外部應(yīng)激因素的影響，已被廣泛用作RT-PCR和Western blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參分子，特別是其作為內(nèi)標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白相對(duì)表達(dá)定量中的應(yīng)用。
采用不同鼠源單克隆抗體系統(tǒng)排查了目前常用于真核生物蛋白表達(dá)相對(duì)定量的內(nèi)標(biāo)蛋白，包括（3-actin，a-tubulin和GAPDH等，以期找到一個(gè)既適合于真核生物蛋白表達(dá)相對(duì)定量又適合于原核生物蛋白表達(dá)相對(duì)定量的通用型內(nèi)標(biāo)蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用鼠源GAPDH單克隆抗體可特異性地檢測(cè)到微生物大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中的GAPDH蛋白，并且在誘導(dǎo)劑異丙基|3-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-(3-d-thiogalactoside,IPTG)存在的條件下內(nèi)源性GAPDH蛋白的表達(dá)水平十分穩(wěn)定，不隨誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的增加而改變。
參考文獻(xiàn)
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