背景[1-6]
Imperial Protein Stain是一種即用型比色染料，采用考馬斯染料R-250配制而成，可在聚丙烯酰胺電泳凝膠中提供一致的納克級蛋白質(zhì)檢測。Imperial Protein Stain是一種考馬斯染料試劑，用于檢測十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和2D凝膠中的蛋白質(zhì)條帶。該染色劑是考馬斯亮藍R-250的獨特配方，與自制或其他商業(yè)染色相比，可顯著改善蛋白質(zhì)染色性能。染色產(chǎn)生強烈著色的蛋白質(zhì)條帶，易于使用凝膠成像儀拍攝和記錄。該試劑是可用的最靈敏的比色染料之一，每個條帶容易檢測3至6納克蛋白質(zhì)。Imperial Protein Stain方案使用簡單的水洗步驟而不是甲醇/乙酸固定和脫色，這節(jié)省了寶貴的準備時間并限度地降低了試劑成本。
特點[1-6]
Imperial蛋白染色的特點：
•敏感-使用增強的方案檢測每個帶少于3ng蛋白質(zhì)（3小時）
•快速使用的試劑在20分鐘內(nèi)檢測到每個帶少于6ng蛋白質(zhì)
•穩(wěn)健-高度一致，可重復的蛋白質(zhì)染色技術(shù)
•高對比度-強烈的紫色條帶比典型的考馬斯藍色斑點更容易拍攝或掃描
•多功能-與下游質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)測序兼容
•只需方便的水洗;無需酸固定劑或甲醇脫色溶液
•穩(wěn)定的1年室溫穩(wěn)定性確保一致的性能并節(jié)省冰箱空間
•靈活調(diào)整染色和洗滌時間，以滿足時間和靈敏度要求
Imperial Protein染色劑是考馬斯亮藍R-250的獨特配方，與自制或其他市售的基于考馬斯的染色劑相比，可顯著改善蛋白質(zhì)染色性能。易于遵循的協(xié)議可靈活滿足苛刻的時間和靈敏度要求。使用Imperial Protein Stain不會導致與其他考馬斯G-250染色制劑相關(guān)的問題（例如，染色一致性）。
除了比標準考馬斯G-250染色劑更快的蛋白質(zhì)條帶開發(fā)和更高的靈敏度外，Imperial Protein Stain不需要甲醇/乙酸固定和脫色，節(jié)省了寶貴的準備時間并限度地降低了試劑成本。
應用[7][8]
用于多巴胺醌對LDHB和ENO1酶活性的影響研究。
帕金森病作為一種常見的的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病原因尚不清楚。我們認為神經(jīng)元細胞內(nèi)游離的多巴胺能夠氧化產(chǎn)生多巴胺醌,多巴胺醌能夠結(jié)合并修飾蛋白,使蛋白功能喪失,導致細胞死亡。本實驗用多巴胺對體外純化的LDHB和ENO1酶蛋白進行處理,來研究多巴胺氧化產(chǎn)生的多巴胺醌對酶蛋白活性的影響,進而探究多巴胺醌毒性與帕金森病之間的關(guān)系。方法:體外擴增LDHB和ENO1酶蛋白基因序列,將兩種蛋白基因序列分別連接進入表達載體pProEX-HTb。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21表達感受態(tài)菌中,利用IPTG(Isopropy1β-D-Thiogalactoside)誘導蛋白表達。超聲破碎菌體提取蛋白,利用Ni-NTA親和層析法對兩種蛋白進行純化。加入相應的酶底物,通過吸光度變化來檢測酶生物活性。在不同條件下用多巴胺對酶蛋白進行處理,之后對樣品的酶活性進行測定。將經(jīng)過處理的樣品進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,利用考馬斯染色法和NBT/甘氨酸鹽顯色法對蛋白樣品進行分析。最后通過蛋白免疫印跡實驗,分析LDHB蛋白樣品中的醌結(jié)合蛋白。
結(jié)果:體外擴增的LDHB和ENO1蛋白基因序列測序無錯配。誘導表達純化的兩種蛋白具有生物催化活性。用相同濃度的多巴胺對LDHB和ENO1蛋白處理不同時間之后,隨著處理時間的增加,LDHB和ENO1蛋白酶活性的損失都增加。經(jīng)過不同DA濃度處理相同時間后,隨著DA處理濃度增加,兩種蛋白酶活性損失增加,蛋白酶活性下降;若在處理樣品中預加入谷胱甘肽(GSH),能夠阻止酶活性的損失,使蛋白保持活性。酪氨酸酶催化多巴胺氧化生成多巴胺醌,但不會生成活性氧等產(chǎn)物,生成的多巴胺醌降低了蛋白酶催化活性,同樣預加入谷胱甘肽后,蛋白活性損失消失。
考馬斯染色結(jié)果顯示經(jīng)過多巴胺處理的蛋白樣品中生成多聚物,多聚物的量與處理時間以及處理濃度成正比;NBT/甘氨酸鹽染色結(jié)果表明處理樣品中的多聚物,是由于多巴胺醌修飾產(chǎn)生的蛋白積聚。而谷胱甘肽能夠阻止蛋白樣品中多聚物形成。最后對LDHB蛋白進行Western Blots實驗,結(jié)果表明處理的樣品中的多聚物是醌結(jié)合的LDHB蛋白。結(jié)論:體外表達純化的LDHB和ENO1蛋白具有一定的生物催化活性。純化的LDHB和ENO1蛋白經(jīng)過多巴胺處理,多巴胺氧化生成的多巴胺醌能夠結(jié)合并修飾蛋白,使蛋白聚集形成多聚物,降低了蛋白酶活性。
參考文獻
[1]Interaction ofα-synuclein with biomembranes in Parkinson’s disease—role of cardiolipin[J].Stephanie Ghio,Frits Kamp,Ruben Cauchi,Armin Giese,Neville Vassallo.Progress in Lipid Research.2016
[2]In vivo protein targets for increased quinoprotein adduct formation in aged substantia nigra[J].Guohua Yu,Huiyan Liu,Wei Zhou,Xuewei Zhu,Chao Yu,Na Wang,Yi Zhang,Ji Ma,Yulan Zhao,Yuanyuan Xu,Lujian Liao,Hongfang Ji,Chonggang Yuan,Jiyan Ma.Experimental Neurology.2015
[3]Role of membrane contact sites in protein import into mitochondria[J].Susanne E.Horvath,Heike Rampelt,Silke Oeljeklaus,Bettina Warscheid,Martin van der Laan,Nikolaus Pfanner.Protein Science.2015(3)
[4]Preconditioning as a Potential Strategy for the Prevention of Parkinson’s Disease[J].Mojtaba Golpich,Behrouz Rahmani,Norlinah Mohamed Ibrahim,Leila Dargahi,Zahurin Mohamed,Azman Ali Raymond,Abolhassan Ahmadiani.Molecular Neurobiology.2015(1)
[5]Protective and toxic roles of dopamine in Parkinson’s disease[J].Juan Segura‐Aguilar,Irmgard Paris,Patricia Mu?oz,Emanuele Ferrari,Luigi Zecca,Fabio A.Zucca.J.Neurochem..2014(6)
[6]Dopamine Cytotoxicity Involves Both Oxidative and Nonoxidative Pathways in SH-SY5Y Cells:Potential Role of Alpha-Synuclein Overexpression and Proteasomal Inhibition in the Etiopathogenesis of Parkinson’s Disease[J].Kalpita Banerjee,Soumyabrata Munshi,Oishimaya Sen,Vishmadeb Pramanik,Tapasi Roy Mukherjee,Sasanka Chakrabarti,Nobutaka Hattori.Parkinson’s Disease.2014
[7]Dopamine quinone modifies and decreases the abundance of the mitochondrial selenoprotein glutathione peroxidase 4[J].David N.Hauser,April A.Dukes,Amanda D.Mortimer,Teresa G.Hastings.Free Radical Biology and Medicine.2013
[8]魏代鑫.多巴胺醌對LDHB和ENO1酶活性的影響[D].華東師范大學,2017.