背景及概述^[1][2]

黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類(lèi)致癌物。目前已鑒定 分離出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ1和AFH1等十多種黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，簡(jiǎn)稱(chēng)AFB1）的毒性和致癌性最強(qiáng)。AFB1的強(qiáng)毒性、高致癌性以及存在的廣泛性，對(duì)人類(lèi)健康安全和畜牧業(yè)等造成了嚴(yán)重的威脅。

檢測(cè)^[1]

目前可分離定量檢測(cè)AFB1的方法主要有薄層色譜法，高效液相色譜法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以及免疫分析方法。這些方法大多需要體積龐大、價(jià)格昂貴的檢測(cè)設(shè)備，并且操作步驟繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不利于現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)一種基于血糖儀檢測(cè)黃曲霉素 B1的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉素B1這一非糖靶目標(biāo)的快速簡(jiǎn)單、高靈敏度檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

一種利用血糖儀定量檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法，包括以下步驟：

步驟一：制備納米金-蔗糖酶-核酸適配體檢測(cè)探針復(fù)合物；

步驟二：將黃曲霉毒素B1的單克隆抗體，4℃孵育12h；用緩沖液B沖洗；然后加入封閉緩沖液，室溫封閉1h；用緩沖液A沖洗，完成黃曲霉毒素B1的單克隆抗體的固定；

步驟三：向步驟二的黃曲霉毒素B1的單克隆抗體中加入不同濃度的黃曲霉毒素B1待測(cè) 液，37℃孵育1h，使黃曲霉毒素B1與黃曲霉毒素B1的單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，用緩沖液 A沖洗未與單克隆抗體結(jié)合的黃曲霉毒素B1，得到黃曲霉毒素B1與單克隆抗體的結(jié)合體；

步驟四：在步驟三所得的結(jié)合體中加入步驟一制備的納米金-蔗糖酶-核酸適配體檢測(cè) 探針復(fù)合物，37℃孵育2h，形成具有夾心式結(jié)構(gòu)的單克隆抗體-黃曲霉毒素B1-檢測(cè)探針復(fù) 合物，未與結(jié)合體上的黃曲霉毒素B1結(jié)合的納米金-蔗糖酶-核酸適配體檢測(cè)探針復(fù)合物留在上層上清液中；

步驟五：取步驟四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖儀進(jìn)行定量檢測(cè)。

進(jìn)一步地，所述制備納米金-蔗糖酶-核酸適配體檢測(cè)探針復(fù)合物的步驟如下：

a）將蔗糖酶加入到膠體金中混合，4℃孵育6h，得到納米金-蔗糖酶復(fù)合物；

b）向黃曲霉毒素B1的核酸適配體中加入TCEP試劑，室溫，黑暗條件下，反應(yīng)2h激活黃曲 霉毒素B1的核酸適配體；

c）將步驟b）激活后的黃曲霉毒素B1的核酸適配體加入到步驟a）的納米金-蔗糖酶復(fù)合 物中，在振蕩培養(yǎng)箱中50r/min、37℃孵育16h，形成納米金-蔗糖酶-核酸適配體復(fù)合物；

d）將步驟c）的納米金-蔗糖酶-核酸適配體復(fù)合物離心，取出上清液，先用少量的緩沖 液A沖洗沉淀物，再用緩沖液A溶解沉淀物，室溫渦旋震蕩5min，得到納米金-蔗糖酶-核酸適 配體檢測(cè)探針，并在4℃保存。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本方法的有益效果在于：

1.本方法采用膠體金作為標(biāo)記物，因?yàn)槟z體金能穩(wěn)定又迅速地吸附蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì) 的生物活性無(wú)明顯改變，它可以作為探針對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)、多膚、抗原、激素、核酸等生物大分子的精確定位；同時(shí)膠體金具有以下特點(diǎn)：使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場(chǎng)使用成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備；應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測(cè)條件，可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，多項(xiàng)檢測(cè)可以節(jié)省樣品；降低成本，標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4℃貯存兩年年以上，無(wú)信號(hào)衰減現(xiàn)象；

2.傳統(tǒng)的檢測(cè)大分子物質(zhì)的方法，都是單一利用抗體與目標(biāo)物結(jié)合，或是核酸適配體與目標(biāo)物結(jié)合，從而間接測(cè)出目標(biāo)物的量，而本方法中形成了具有夾心式結(jié)構(gòu)的單克隆抗 體-目標(biāo)物（黃曲霉毒素B1）-檢測(cè)探針復(fù)合物，通過(guò)抗體、核酸適配體同時(shí)與目標(biāo)物結(jié)合，具有更強(qiáng)的特異性，且與待測(cè)物中的目標(biāo)分子結(jié)合效果更好，通過(guò)檢測(cè)上清液中剩余的納米金-蔗糖酶-核酸適配體檢測(cè)探針復(fù)合物的量，得到較強(qiáng)的血糖儀信號(hào)值，使得檢測(cè)結(jié)果更加精確、定量檢測(cè)范圍更廣；

3.本方法利用家用便攜式血糖儀進(jìn)行檢測(cè)，相比利用傳統(tǒng)的大型檢測(cè)設(shè)備，具有體積小、成本低和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，可為日常生活、生產(chǎn)等方面提供一種黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)方法，保障食品安全。

去除方法^[2]

現(xiàn)有技術(shù)中去除黃曲霉毒素B1的方法有：氨化法(是美國(guó)專(zhuān)利方法)，該法用于含水飼料的毒素去除，有效率達(dá)98％，但因處理后食品中含大量的氨，美國(guó)FDA規(guī)定此法不能用于食品加工。NaOH法(曾用于植物油除去毒素)，用強(qiáng)堿把毒素變成鹽，再用水洗。由于設(shè)備投資大、油耗大、成本高的缺點(diǎn)，現(xiàn)已被淘汰；混合溶劑萃取法：用一些有機(jī)溶劑如：95％乙醇溶液，80％2-丙醇，90％丙醇及多種乙烷和乙醇混合物從樣品中萃取黃曲霉毒素B1，該方法用于如花生粉，棉籽等固態(tài)食品的毒素去除，效率可達(dá)93-98％，能保持產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，但在萃取、溶劑回收和處理時(shí)花費(fèi)昂貴，無(wú)推廣應(yīng)用價(jià)值。

高溫法：用高壓鍋蒸煮污染的花生食品2小時(shí)或 在含水量20％條件下將食品在100℃加熱2小時(shí)；由于黃曲霉毒素B1 耐熱，須超過(guò)250℃高溫才會(huì)分解，但過(guò)高溫度同時(shí)會(huì)破壞食品中 的基他營(yíng)養(yǎng)成分，故不作為解毒的主要手段。其他如：次氯酸鈉、 臭氧、過(guò)氧化氫、甲醛、氯氣等化學(xué)法，它們運(yùn)用強(qiáng)烈的化學(xué)試劑 破壞毒素，所以，同時(shí)也破壞了食品中的許多營(yíng)養(yǎng)成分。超濾-滲濾 法，用該法處理的全奶其AFM1含量可由最初的2.5μg/L下降到0.5 μg/L，但經(jīng)處理后的牛奶、脂肪、乳糖以及灰分和總固形物最高可 損失23％，且該法對(duì)均相化或酸化的牛奶無(wú)效。

一種黃曲霉毒素B1解毒酶去除黃曲霉毒素B1的方法，其特征是將黃曲霉毒素B1解毒酶直接與含毒樣品作用，體系呈PH7.0-8.5，或間接地先以載體固定化后再與含毒樣品作用，于20-70℃作用5-120 分鐘。

——所述地載體可以是甲殼素、硅膠、氧化鋁、瓊脂珠、多孔 玻璃珠等多孔材料、惰性基質(zhì)、或經(jīng)活化處理的惰性基質(zhì)。

——所述的含毒樣品可以是植物油、醬油啤酒、奶及其制品。

下面通過(guò)實(shí)施例作進(jìn)一步詳述：

取含毒樣品10ml，加入黃曲霉毒素B1解毒酶400μg，用磷酸鹽緩沖液調(diào)至體系PH7.5，在溫度為40℃作用40分鐘即可去除樣品中的黃曲霉毒素B1。 本發(fā)明的方法專(zhuān)一，高效，溫和和安全。該解毒酶能夠破壞黃曲霉毒素B1的致毒、致癌活性，能夠較好地保持食品的原有品質(zhì)，因而本發(fā)明可安全無(wú)毒地用于食品加工業(yè)。

主要參考資料

[1] CN201710050280.0一種利用血糖儀定量檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法

[2] CN99117161.6 黃曲霉毒素B1解毒酶去除黃曲霉毒素B1的方法