背景[1-6]
快速末端修復(fù)A尾添加模塊是針對(duì)Illumina®高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建而專業(yè)設(shè)計(jì)的DNA末端修復(fù)/A尾添加模塊，具有高效、快速、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)。本產(chǎn)品兼容1 ng-1μg片段化Input DNA，可在單管內(nèi)實(shí)現(xiàn)片段化DNA的末端補(bǔ)平、5端磷酸化和3端加A尾反應(yīng)，得到5末端含磷酸基團(tuán)且3末端帶有dA突出的DNA產(chǎn)物。該產(chǎn)物無(wú)需純化，即可使用Hieff NGSTM Fast-Pace DNA Ligation Module進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建接頭連接反應(yīng)。
快速末端修復(fù)A尾添加模塊與Hieff NGSTM Fast-Pace DNA Ligation Module，2×Hieff CanaceTM High-Fidelity PCR Master Mix共同用于DNA文庫(kù)構(gòu)建，通過(guò)Illumina®高通量平臺(tái)測(cè)序驗(yàn)證其有效性。本產(chǎn)品中提供的所有試劑組分均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)檢，最高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。 快速末端修復(fù)A尾添加模塊兼容500 pg-1μg片段化Input DNA，可在單管內(nèi)實(shí)現(xiàn)片段化DNA的末端補(bǔ)平、5'端磷酸化和3'端加A尾反應(yīng)，得到5'末端含磷酸基團(tuán)且3'末端帶有dA突出的DNA產(chǎn)物。
質(zhì)量控制：
Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Enzyme
1.SDS-PAGE純度：>95%。
2.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應(yīng)體系中加入10μL本酶和1μgφX174 RF I DNA，37°C孵育4小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),RF II轉(zhuǎn)化比率<10%。
3.磷酸酶活性：在磷酸酶活性檢測(cè)緩沖液中加入10μL本酶和2.5 mM對(duì)硝基苯磷酸，37°C孵育4小時(shí)。經(jīng)光譜測(cè)定法檢測(cè)，405 nm處無(wú)對(duì)硝基苯陰離子特征吸收峰。
4.功能活性：在1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Enzyme中加入1μL本酶和0.5μg包含5和3突出末端的片段化DNA，25°C孵育20分鐘。經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，末端修復(fù)、加dA尾并磷酸化的DNA比率>95%。
Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer
1.16小時(shí)孵育檢測(cè)：50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μg HindIII-λDNA，37°C孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解；50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μg T3 DNA，37°C孵育16小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。
2.核酸內(nèi)切酶活性：50μL反應(yīng)體系中包含1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和1μgφX174 RF I DNA，37°C孵育4小時(shí)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，RF II轉(zhuǎn)化比<10%。
3.RNase活性：在1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C孵育16小時(shí)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，條帶無(wú)降解。
4.磷酸酶活性：在磷酸酶活性檢測(cè)緩沖液中加入1×Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Buffer和2.5 mM對(duì)硝基苯磷酸，37°C下孵育4小時(shí)。經(jīng)光譜測(cè)定法檢測(cè)，405 nm處無(wú)對(duì)硝基苯陰離子特征吸收峰。
應(yīng)用[7][8]
快速末端修復(fù)A尾添加模塊可用于NGS測(cè)序?qū)嶒?yàn)中的DNA文庫(kù)構(gòu)建：
對(duì)馬凡綜合征（Marfan syndrome,MFS）患者和晶狀體脫位綜合征（Ectopia lentis syndrome,ELS）患者的原纖維蛋白-1（fibrillin-1,FBN1）基因,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體1（Transforming Growth Factor Beta Receptor TypeⅠ,TGFBR1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體2（Transforming Growth Factor Beta Receptor TypeⅡ,TGFBR2）進(jìn)行基因突變篩查,有利于明確相應(yīng)患者的患病原因,并可為家系成員的癥狀前檢測(cè)或下一代的產(chǎn)前篩查提供依據(jù)。
方法1.NGS和MLPA技術(shù)在MFS和ELS基因診斷中的應(yīng)用提取22例MFS患者和1例ELS患者的基因組DNA,用第二代測(cè)序技術(shù)（Next generation sequencing,NGS）對(duì)FBN1、TGFBR1和TGFBR2進(jìn)行突變篩查,然后用Sanger測(cè)序?qū)ν蛔兾稽c(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)NGS未發(fā)現(xiàn)突變的病人,再應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）檢測(cè)FBN1、TGFBR1和TGFBR2是否存在大片段缺失/重復(fù)突變,對(duì)這兩種方法提示有基因組大片段突變的外顯子進(jìn)行PCR和DNA Sanger測(cè)序以證實(shí)突變。
2.一個(gè)FBN1純合突變家系的分析提取該先證者和該家系成員外周血全基因組DNA,用NGS技術(shù)對(duì)先證者FBN1進(jìn)行突變篩查,然后用Sanger測(cè)序?qū)ν蛔兾稽c(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證并對(duì)家系成員進(jìn)行突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序。提取先證者主動(dòng)脈組織的RNA,用RT-PCR擴(kuò)增突變所在外顯子,并進(jìn)行Sanger測(cè)序。結(jié)果1.NGS和MLPA技術(shù)在MFS和ELS基因診斷中的應(yīng)用在22例MFS和1例ELS患者（18號(hào)患者）中發(fā)現(xiàn)20種FBN1突變,其中20種突變中有13個(gè)是錯(cuò)義突變、3個(gè)是無(wú)義突變、2個(gè)剪接位點(diǎn)突變、1個(gè)移碼突變、1個(gè)是大片段缺失突變。
參考文獻(xiàn)
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