背景[1-6]
cfDNA Clean Beads是基于一種固相載體可逆化固定（SPRI）的分離純化方法。磁珠體系中一般包含：磁珠、DNA、聚乙二醇（PEG）、以及鹽離子等，在一定濃度的PEG和鹽離子環(huán)境中，DNA可吸附到羧基修飾的高分子磁珠表面（即固相載體），該過程是可逆的，在適當(dāng)條件下，結(jié)合的DNA分子可以被洗脫回收。
納米級(jí)別的磁珠表面性質(zhì)不同，分離原理也不盡相同，但基本上固態(tài)的球狀材料組成并無太大差異，基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)一般分為3層，最內(nèi)層的核心是聚苯乙烯、第二層包裹磁性物質(zhì)——四氧化三鐵（Fe3O4），最外層表面是羧基（-COOH）修飾的高分子材料所構(gòu)成，其中羧基行使與核酸結(jié)合的工作。在整個(gè)體系中，PEG是影響DNA回收的決定性因素（其他因素還包括DNA大小和濃度、鹽離子濃度、孵育時(shí)間等等）。DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl2促進(jìn)條件下，使DNA發(fā)生脫水反應(yīng)，分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生急劇變化，由線狀被壓縮形成卷曲球狀，繼而聚集沉淀，同時(shí)隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，不同長度的DNA可以被選擇性的沉淀出來。
在磁珠體系中，特定分子量的PEG的功能主要是與鹽離子共同作用，改變不同長度DNA的分子構(gòu)象，同時(shí)增加體系的粘稠程度，使磁珠存在其中處于懸浮狀態(tài)，不易沉降，增加磁珠在空間位置的碰撞與排斥，從而增加核酸與磁珠的聚集效率與效果，除此之外，PEG與蛋白質(zhì)具有相容性，也可去除樣品中的蛋白質(zhì)。cfDNA提取過程中，常會(huì)引入大片段DNA或gDNA的污染。常規(guī)情況下，這些污染物可以通過對(duì)目的片段進(jìn)行磁珠分選回收而去除。但是，由于cfDNA僅有170 bp左右，常用的AMPure XP或SPRI Select磁珠對(duì)100-200 bp的回收效率較低，無法獲得理想的cfDNA回收效果。
Hieff NGSTM cfDNA Clean Beads(100-200 bp)是針對(duì)上述問題的解決而專門設(shè)計(jì)的磁珠類產(chǎn)品，其基于SPRI(Solid Phase Reverse Immobilization)原理制備，配合精心優(yōu)化的緩沖體系和已經(jīng)驗(yàn)證的操作體系，可精確回收100-200 bp cfDNA，有效去除大片段DNA和gDNA的污染，同時(shí)具有操作簡單、回收率高（>95%）等優(yōu)勢。使用本品獲得的cfDNA產(chǎn)物，可直接應(yīng)用二代測序文庫構(gòu)建、克隆、酶切、連接等反應(yīng)。本產(chǎn)品中提供的所有試劑組分均經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)檢，zui高程度保障產(chǎn)品優(yōu)異性能與批間穩(wěn)定性。
注意事項(xiàng)：
1）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
2）磁珠使用前須在室溫平衡至少30 min。
3）80%乙醇需現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。
4）進(jìn)行長度分選時(shí)，初始樣品體積需≥50μL，不足時(shí)請(qǐng)用超純水補(bǔ)齊。樣品體積太小，將導(dǎo)致移液誤差增大，進(jìn)而影響分選的準(zhǔn)確性。
使用方法：
1.準(zhǔn)備工作
將磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2.長度分選（雙輪法）
1）請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。
2）根據(jù)要求，參考表1向DNA溶液中加入輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。
3）室溫孵育5 min。
4）將離心管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中?！咀⒁猓恨D(zhuǎn)移上清時(shí)，請(qǐng)勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。】
5）向上清中加入第二輪分選磁珠。
6）渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。
7）將離心管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
8）保持EP管始終處于磁力架中，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
9）重復(fù)步驟8。
10）保持離心管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。
11）將離心管從磁力架中取出，加入適量ddH2O（≥20μL），渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
12）將離心管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心吸取上清至干凈的管中，即完成純化。
應(yīng)用[7][8]
cfDNA 清理磁珠可用于cfDNA提取實(shí)驗(yàn)的純化：
新一代分析技術(shù)總的發(fā)展方向是更加微型化、自動(dòng)化、快速化和集成化,而近幾年出現(xiàn)的微流控分析(Microfluidic analysis)正是為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)服務(wù)的主要領(lǐng)域之一。微流控分析在其發(fā)展過程中結(jié)合了越來越多的技術(shù),而這些技術(shù)又推動(dòng)了微流控分析領(lǐng)域的不斷發(fā)展。比如磁場和磁性粒子與微流控系統(tǒng)的結(jié)合,雖然時(shí)間并不長,但已在分離分選、控制、捕獲、傳輸和混合上得到很多應(yīng)用,遍及生物、醫(yī)藥、化學(xué)、物理、藥物等各個(gè)領(lǐng)域。
在微流控芯片上使用磁珠提取DNA已經(jīng)有了很多的報(bào)道,集成化程度也很高,但是芯片系統(tǒng)加工比較繁瑣。本工作的主要內(nèi)容是建立基于毛細(xì)管的微流控磁珠DNA提取系統(tǒng)。章介紹了在微流控領(lǐng)域利用磁性物質(zhì)和磁場進(jìn)行微流控操作的進(jìn)展領(lǐng)域結(jié)合產(chǎn)生的功能及其主要運(yùn)用。第二章中介紹了基于毛細(xì)管的微流控磁珠DNA提取系統(tǒng)。系統(tǒng)基于毛細(xì)管構(gòu)建,結(jié)構(gòu)簡單,不需采用昂貴的微加工設(shè)備和復(fù)雜的微加工技術(shù)。系統(tǒng)采用重力驅(qū)動(dòng)液流,操作方便。系統(tǒng)被應(yīng)用于全血中DNA的提取。
參考文獻(xiàn)
[1]Application of Superhydrophobic Surface with High Adhesive Force in No Lost Transport of Superparamagnetic Microdroplet.X.Hong,X.F.Gao,L.Jiang.Journal of the American Chemical Society.2007
[2]Magnetic levitation of microdroplets in air.V.Haguet,C.Jeandey,H.Chetouani,G.Reyne,F.Chatelain.μTAS 2006.
[3]J Microelectromagnet for magnetic manipulation in lab-on-a-chip systems.K.Smistrup,P.T.Tang,O.Hansen,M.F.Hansen.Journal of Magnetism and Magnetic Materials.2006
[4]Cofabrication of Electromagnets and Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).A.C.Siegel,S.S.Shevkoplyas,D.B.Weibel,D.A.Bruzewicz,A.W.Martinez,G.M.Whitesides.Angewandte.2006
[5]A microfabricated bio-magnetic separator based Micro Total Analysis Systems.N.Chronis,W.Lam,L.Lee..2001
[6]Self-Assembly of Colloidal Pyramids in Magnetic Fields.L.E.Helseth.Langmuir.2005
[7]Colloidal Rings in a Liquid Mixture.L.E.Helseth,RM.Muruganathan,Y.Zhang,T.M.Fischer.Langmuir.2005
[8]沈玉勤. 基于毛細(xì)管的磁珠微流控DNA富集提取系統(tǒng)的研究[D].浙江大學(xué),2007.