背景[1-7]
柱式DNA清除劑可用于細胞總RNA樣品中基因組DNA污染的去除。目前zui常用的RNase-free DNase處理方法因DNase中所含殘留的RNase能破壞RNA完整性而具有很大缺陷。柱式非酶DNA清除劑不但徹底避免了RNase-free DNase的這一缺陷。柱式DNA清除劑為非酶產(chǎn)品，可以常溫運輸和4℃長期保存；而RNase-freeDNase的運輸和長期保存必須在低溫進行。
實驗要點
1．CTAB溶液在低于15℃時會析出沉淀，因此在將其加入冷凍的植物材料中之前必須預熱。
2．在最適條件下，DNA—CTAB沉淀呈白色纖維狀，很容易一下子就從溶液中鉤出。不過，某些植物種的DNA沉淀中可能含有雜質(zhì)，特別是多糖，使DNA沉淀呈絮狀或膠狀，這種情況下可能需要稍事離心才能得到DNA.—CTAB沉淀。
3．飽和酚雖然可有效地使蛋白質(zhì)變性，但酚不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚可以溶解含poLy(A)的mRNA。如果用苯酚和氯仿的混合液，可減輕這兩種現(xiàn)象，同時可加入適量的異戊醇（苯酚—氯仿—異戊醇=25:24:1），異戊醇的作用是消泡，并使蛋白質(zhì)層緊密，使水相和有機相分層較好。
細菌的培養(yǎng)和收集將含有質(zhì)粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃培養(yǎng)12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/ml Amp)中,37℃振蕩培養(yǎng)約12小時至對數(shù)生長后期。柱式DNA清除劑小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣,所得DNA有一定純度,可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
注意事項：
1.對大腸桿菌可從固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質(zhì)粒DNA。
2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,濃度高時,細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。
3.提取的質(zhì)粒DNA中會含有RNA,但RNA并不干擾進一步實驗,如限制性內(nèi)切酶消化,亞克隆及連接反應等。
應用[8][9]
柱式DNA清除劑可用于血液、組織及細菌RNA提取實驗中DNA污染的去除：
在苦瓜降血糖多肽-P差異表達方法的建立及其篩選應用實驗中需要去除基因組DNA?？喙献鳛橐环N常見的藥食兩用的植物,其降血糖活性早已得到廣泛的認可并被動物實驗和臨床實驗所證實?？喙辖笛浅煞种饕譃樵碥蘸投嚯膬纱箢?其中降血糖多肽P早在20世紀九十年代已進行了分離純化和藥效研究,課題組前期研究中首次獲得了降血糖多肽P的基因序列。
本課題主要研究目標為：1在分子水平對不同苦瓜品種的降糖多肽P建立表達差異性研究系統(tǒng)；2根據(jù)建立的系統(tǒng)篩選優(yōu)質(zhì)的降血糖苦瓜品種。首先,為了獲得優(yōu)質(zhì)的RNA,以滿足后續(xù)不同苦瓜品種降血糖多肽-P表達研究,本文通過對RNA抽提方法的優(yōu)化,獲得了不同品種高質(zhì)量的苦瓜RNA；通過三種去除RNA中DNA殘留不同方法的比較,成功地確定了一種高效的去除RNA中微量DNA污染的方法；通過RNA逆轉錄反應,在不同品種苦瓜中得到了含有多肽P序列的cDNA產(chǎn)物。
其次,利用實時定量PCR,建立篩選優(yōu)質(zhì)降血糖苦瓜品種的方法,需要選擇合適的苦瓜內(nèi)參基因。根據(jù)葫蘆科植物β-actin保守序列設計了引物,用該引物成功獲得了一段長為329bp,含88bp內(nèi)含子結構的苦瓜β-actin基因序列；通過在形態(tài)差異較大、地域不同的苦瓜品種進行表達穩(wěn)定性檢測,確定了該基因可作為實時定量PCR研究苦瓜多肽P表達的內(nèi)參基因；另外,通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找,成功地獲得了苦瓜18S rRNA基因,并確定了其作為苦瓜內(nèi)參基因的可能性。
最后,將獲得的苦瓜p-actin內(nèi)參基因引物和多肽P特異性引物進行溶解曲線和標準曲線分析,確保這些引物適合于實時熒光定量PCR的分析。選取八種外觀差異明顯,產(chǎn)地不同的苦瓜,以β-actin作為內(nèi)部參比對照,經(jīng)實時熒光定量PCR分析,確定了具有高表達多肽P的純豐綠皮和H&V苦瓜品種。
參考文獻
[1]Natural medicines from plant source used for therapy of diabetes mellitus:An overview of its pharmacological aspects[J].DK Patel,R Kumar,D Laloo,S Hemalatha.Asian Pacific Journal of Tropical Disease.2012(3)
[2]Nutritional constituents and medicinal values of Momordica cymbalaria(Athalakkai)–A review[J].R.A.Jeyadevi,T.Sivasudha,A.Rameshkumar,B.Sangeetha,D.Arul Ananth,G.Smilin Bell Aseervatham.Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine.2012(1)
[3]Antihyperglycemic and hypolipidemic effects of Melothria maderaspatana and Coccinia indica in Streptozotocin induced diabetes in rats[J].Ashok Kumar Balaraman,Jagadish Singh,Sasmita Dash,Tapan Kumar Maity.Saudi Pharmaceutical Journal.2010(3)
[4]Oxidative stress,insulin signaling,and diabetes[J].Justin L.Rains,Sushil K.Jain.Free Radical Biology and Medicine.2010(5)
[5]Antidiabetic Activity of Ethanolic Extract of Zaleya decandra in Alloxan-Induced Diabetic Rats[J].Periasamy Meenakshi,Rajendran Bhuvaneshwari,Muthaiyan Ahalliya Rathi,Lakshmanan Thirumoorthi,Dugganaboyana Chinna Guravaiah,Muthedath Janardhanan Jiji,Velliyur Kanniappan Gopalakrishnan.Applied Biochemistry and Biotechnology.2010(4)
[6]Isolation and characterization of a novel antihyperglycemic protein from the fruits of Momordica cymbalaria[J].Maddirela Dilip Rajasekhar,Kameswara Rao Badri,Kondeti Vinay Kumar,Ramesh Babu Kassetti,Shaik Sameena Fatima,Mekala Thur Sampath Kumar,Chippada Appa Rao.Journal of Ethnopharmacology.2009(1)
[7]Hypoglycaemic effect of comatin,an antidiabetic substance separated from Coprinus comatus broth,on alloxan-induced-diabetic rats[J].Zhongyang Ding,Yingjian Lu,Zhaoxin Lu,Fengxia Lv,Yuhong Wang,Xiaomei Bie,Feng Wang,Kechang Zhang.Food Chemistry.2009(1)
[8]Antidiabetic activity of Diospyros peregrina fruit:Effect on hyperglycemia,hyperlipidemia and augmented oxidative stress in experimental type 2 diabetes[J].Saikat Dewanjee,Anup K.Das,Ranabir Sahu,Moumita Gangopadhyay.Food and Chemical Toxicology.2009(10)
[9]劉威.苦瓜降血糖多肽-P差異表達方法的建立及其篩選應用[D].華東理工大學,2013.